cGMP和Ca2+通過提升PM H+-ATPase活性降低Na+/K+比維持苔草愈傷組織離子穩(wěn)態(tài)

賈紅磊， 馬佩云

(陜西科技大學 環(huán)境科學與工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

在世界許多地區(qū)，土壤鹽分過高一直是農業(yè)生產的主要制約因素，目前土壤鹽堿化和次生鹽堿化問題在世界范圍內廣泛存在，已經(jīng)成為影響植物生長發(fā)育的重要環(huán)境因素[1].當植物暴露于NaCl中時，細胞離子穩(wěn)態(tài)可能會受到損害.越來越多的證據(jù)表明，耐鹽植物在高鹽條件下細胞胞漿中通常保持高鉀(K+)和低鈉(Na+)[2].植物細胞離子穩(wěn)態(tài)調節(jié)過程是由多個運輸系統(tǒng)介導的，如H+-ATPase、載體(轉運蛋白和逆向轉運蛋白)及與質膜(PM)和液泡膜相關的通道[3].

從細胞質和液泡中有效地排除過量的Na+是植物適應鹽脅迫的主要機制[4].作為一種初級轉運體，PM H+-ATPase介導ATP依賴的H+進入細胞外間隙，從而在PM之間產生pH和電位差[5].對PM H+-ATPase活性的調控可能是提升植物耐鹽性的重要調控機制.

環(huán)鳥苷酸(cGMP)是一種重要的第二信使分子，通過直接的上下游效應調節(jié)復雜的信號傳遞[6].研究報道cGMP在葉綠體發(fā)育、大麥α淀粉酶誘導和鹽脅迫下維持細胞離子平衡中的作用[7].cGMP在生物、非生物脅迫及傳遞植物激素信號響應植物生理過程起著非常重要的作用[8].

鈣離子(Ca2+)是動物和植物中的關鍵第二信使分子[9].在植物中，Ca2+瞬變介導了對環(huán)境脅迫的反應，包括鹽、干旱、寒冷等[10].Ca2+信號賦予酶活性、細胞結構和基因表達的變化，這些變化共同使植物能夠應對不斷變化的環(huán)境[11].Ca2+還涉及各種信使分子，如環(huán)鳥苷酸(cGMP)、(過氧化氫)H2O2等.McAinsh等[12]發(fā)現(xiàn)，外源性H2O2誘導了保衛(wèi)細胞內Ca2+的升高，且cGMP水平與Ca2+水平同步增加，它們協(xié)同又獨立地發(fā)揮作用[13].

苔屬植物是被子植物中最大的屬之一，在世界范圍內有2 000多種[14]，多分布在濕地、北極和高山植被Carexmoorcroftii是一種生長在中國西北部高海拔地區(qū)的植物.它在穩(wěn)定沙丘和為中國西北部的動物提供食物方面也起著非常重要的作用.沙生型(DC)生長在含有一定量的石膏、碳酸鈣和鹽的土壤中.因此，DC具有極強的抗旱性和較強的耐鹽性[4].因此，選取它為研究植物適應各種環(huán)境條件的理想材料，將另一種全年生長在濕地水生型(SC)作為對照進行研究，探索信號分子cGMP和Ca2+參與維持鹽脅迫下C.moorcroftii愈傷組織細胞內離子穩(wěn)態(tài)的作用，使人們對耐鹽植物有更深一步的了解，從而采取相應的策略去利用它們改良鹽堿地以及創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益和社會效益，并為在鹽堿地苔屬植物的種植以及耐鹽生理機制的研究提供一定的科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)

兩種生態(tài)型C.morcroftii植物種子從中國青海省唐古拉縣獲得 (34 °16′04″N，92 °29′47″E)，愈傷組織從成熟的種子中獲得.愈傷組織在濕度為70%和光周期為16 h、溫度保持在24 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4個月.稱取0.50±0.05 g的愈傷組織置于30 mL的MS固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)22天后，對愈傷組織進行不同處理.

首先，采用0、100 mM、200 mM、300 mM的NaCl處理愈傷組織24 h，對不同處理下的離子滲透率、相對含水量及Na+、K+含量進行測定，確定合適濃度的NaCl進行后續(xù)實驗.其次采用既定NaCl濃度與0.5μM、5μM、50μM、100μM的8-Br-cGMP處理愈傷組織，測定Na+、K+含量,以確定最佳8-Br-cGMP的濃度.

然后,采用確定濃度的8-Br-cGMP、cGMP抑制劑(50μM Ly83583)、Ca2+螯合劑(10 mM EGTA)處理6 h后,測定愈傷組織中Na+、K+含量、cGMP合成量以及PM H+ATPase活性來探究cGMP及Ca2+在調節(jié)鹽脅迫中細胞內離子穩(wěn)態(tài)方面的生理作用.

1.2 實驗方法

1.2.1 離子滲透率測定

采用Sairam等[15]的方法測定離子滲透率.用去離子水收集和洗滌愈傷組織三次，以去除表面粘附的電解質.然后將洗滌后的樣品放置在試管中，在25 ℃下浸入10 mL去離子水中3 h.孵育后，測定浸泡液的電導率(C1)，并測定去離子水的電導率(C0).之后，在沸水中加熱1 h，根據(jù)公式(1)測定浸泡液的電導率(C2)，相對離子滲透率以電導率的百分比表示.

EL=(C1-C0)/(C2-C0)×100%

(1)

1.2.2 相對含水量(RWC)測定

稱取新鮮愈傷組織的鮮重(FW)，在80 ℃下加熱48 h之后稱其干重(DW)，根據(jù)公式(2)測定相對含水量.

RWC=(FW-DW)/FW×100%

(2)

1.2.3 Na+、K+含量測定

元素比測量使用安裝Kevex能量色散X射線探測器的掃描電子顯微鏡(菲利普斯電子公司，埃因達倫，荷蘭)采用X射線顯微分析方法測定Na+及K+含量.愈傷組織用去離子水沖洗5次，然后在50 ℃下干燥48 h.將干燥的愈傷組織用研缽粉碎，每個樣本至少檢測三個點，測定組織中Na+、K+的含量，Na+、K+的含量以Na+、K+的原子序數(shù)百分比表示.

1.2.4 cGMP提取及測定

樣品收集后迅速冷凍在液氮中.在冷凍組織中加入5倍體積0.1 M HCl.樣品在冰上用多管型勻漿器將其研磨至勻漿，在4 000 g下離心5 min，收集上清液進行分析.用cGMP免疫分析試劑盒(Bio Vision，USA)測定cGMP含量.

1.2.5 PM H+-ATPase活性測定

采用Yang等[16]描述的方法提取PM.質膜蛋白用于PM H+-ATPase活性的測定.測定PM H+-ATPase的活性.

1.2.6 蛋白印跡分析

根據(jù)Laemmli[17]描述的方法采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行蛋白印跡分析.在含6 M尿素的11.5% (w/v)丙烯酰胺凝膠上負載和分離約50 mg總蛋白.電泳后分離的蛋白質被轉移到聚乙烯膜上.用5%脫脂牛奶在0.5% (w/v) Tween 20、10 mM Tris-HCl (pH=8.0)和150 mM NaCl封閉90 min.加入PM Na+/H+逆向轉運蛋白抗體孵育過夜.洗滌后，加入堿性磷酸酶偶聯(lián)的第二抗體，孵育2 h，按照說明書進行測定.以牛血清白蛋白為標準用Bradford法[18]測定蛋白質含量.

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實驗所有指標都重復測定三次，采用Origin 8.0軟件進行數(shù)據(jù)作圖，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，平均值采用SPSS統(tǒng)計軟件17.0進行Tukey檢驗.圖中不同字母代表平均值在p<0.05水平有統(tǒng)計學差異.

2 結果與討論

2.1 NaCl對離子滲透率(EL)、相對含水量(RWC)的影響

由于離子滲透率(EL)和相對含水量(RWC)被認為是應激誘導細胞損傷的良好指標.因此，在鹽脅迫下，測定了水生型(SC)、沙生型(DC)愈傷組織中的EL和RWC.如圖1(a)所示，在100 mM及200 mM NaCl處理下，EL與未處理的DC愈傷組織無顯著性差異，而SC愈傷組織則分別增加了83.7%和122.3%.在較高NaCl濃度(300 mM)處理下，DC愈傷組織EL增加97.8%，SC愈傷組織增加133.4%.如圖1(b)所示，在100 mM至300 mM NaCl濃度處理中，SC和DC愈傷組織中的RWC分別下降了11.6%～15.7%和6.5%～11.9%.試驗結果表明，DC愈傷組織在低濃度NaCl處理下比SC愈傷組織的耐受性強.

(a)離子滲透率(EL)

(b)相對含水量(RWC)圖1 NaCl對DC及SC離子滲透率、相對含水率的影響

2.2 NaCl提高愈傷組織中Na+/K+比值

細胞內離子平衡與植物對鹽脅迫的適應密切相關.控制凈Na+流入并保持細胞質中較低的Na+/K+比對植物鹽耐受性提升具有重要意義[19].在100 mM與200 mM NaCl處理時，SC愈傷組織Na+百分比分別顯著性增加104.2%和192%，K+百分比下降15.6%和31.1%，導致SC愈傷組織Na+/K+比急劇增加，而在DC愈傷組織中Na+/K+比無顯著性變化(圖2(a)～(c)).當采用300 mM NaCl處理時，SC和DC愈傷組織Na+/K+比均明顯增加(圖2(c)).唐曉倩等[20]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度NaCl處理下，西伯利亞白刺可以通過增加根系離子含量提高根系滲透勢差來適應鹽脅迫，與本研究結果一致.

(a)Na+含量

(b)K+含量

(c)Na+/K+圖2 NaCl對DC和SC愈傷組織元素比的影響

以上實驗結果表明，與SC愈傷組織相比，100 mM及200 mM NaCl處理下DC愈傷組織的EL、RWC和Na+/K+比略有變化，說明DC愈傷組織比SC愈傷組織具有更強的耐鹽性.因此，本研究旨在了解DC愈傷組織耐鹽性的原因.綜合考慮，本研究采用100 mM NaCl處理進行后續(xù)實驗.

2.3 鹽脅迫下cGMP和EGTA對Na+/K+比的影響

cGMP被認為是第二個抗環(huán)境脅迫的信使分子[21]，本文研究了8-Br-cGMP(cGMP類似物)對鹽脅迫下DC和SC愈傷組織元素比的影響.在DC和SC愈傷組織中，8-Br-cGMP處理可降低Na+百分比和Na+/K+比率，在鹽脅迫條件和對照條件下增加K+百分比.用50μM 8-Br-cGMP處理，Na+百分比達到最小值(SC愈傷組織中是對照組的108%，DC愈傷組織是對照組的55.5%)，K+百分比達到最大值(SC愈傷組織中是對照的106%，DC愈傷組織中是對照的126%)，從而在鹽脅迫下產生最小的Na+/K+比(圖3(a)～(c)).說明50μM 8-Br-cGMP能夠顯著降低Na+含量以及Na+/K+比.Li等[22]在擬南芥根系中也發(fā)現(xiàn)cGMP能夠維持較低的Na+/K+比緩解鹽脅迫造成的損傷.從細胞質中有效地排除多余的Na+植物適應鹽脅迫的主要機制[23].基于以上結果，在后續(xù)實驗中使用50μM 8-Br-cGMP.

(a)Na+含量

(b)K+含量

(c)Na+/K+圖3 8-Br-cGMP對鹽脅迫下DC和SC愈傷組織中元素比的影響

作為一種信號分子，cGMP在脅迫條件下參與了許多非生物脅迫反應，產生cGMP來激活植物的抗性機制[24].Ca2+作為上游或下游成分參與植物抗性防御和許多信號分子功能[25].外源Ca2+的應用已被證明能顯著緩解鹽脅迫對許多物種造成的危害[26].為了闡明cGMP及Ca2+在耐鹽植物的作用，本研究采用Ly83583(cGMP抑制劑)及EGTA(Ca2+螯合劑)兩種試劑對愈傷組織中Na+/K+比率進行測定.如圖4所示，Ly83583可顯著提高Na+百分比，降低K+百分比，從而使DC和SC愈傷組織在鹽脅迫下的Na+/K+比急劇增加.此外還發(fā)現(xiàn)，EGTA處理可以消除8-Br-cGMP對DC和SC愈傷組織鹽脅迫下元素比的影響(圖4(c)).基于以上結果，本研究得出結論，cGMP的產生是通過影響DC愈傷組織的元素比來提高鹽耐受性.相反，在耐鹽性較差的SC愈傷組織中，Na+不能從植物細胞中排出，離子穩(wěn)態(tài)性能較弱.

2.4 DC和SC愈傷組織中內源cGMP的含量

采用不同處理方法，在DC和SC愈傷組織中檢測內源性cGMP(環(huán)鳥苷酸)含量.由圖5可知，應用8-Br-cGMP可顯著提高內源cGMP含量 (SC愈傷組織中是對照的213%，DC愈傷組織中是對照的239%).鹽脅迫下DC愈傷組織的內源cGMP含量增加了64.1%，而SC愈傷組織的內源cGMP含量下降了32.5%.在DC愈傷組織中8-Br-cGMP+NaCl處理增強了NaCl對內源cGMP含量的影響，但消除了NaCl對SC愈傷組織內源性cGMP含量的影響.相反，Ly83583+NaCl處理降低了DC和SC愈傷組織的內源cGMP含量.

南文斌[27]研究發(fā)現(xiàn)，Ly83583也顯著性降低擬南芥根部內源cGMP含量，影響了根系生長發(fā)育.說明內源cGMP的合成對植物生長至關重要.然而，在100 mM NaCl處理下，EGTA處理并未改變內源cGMP水平.因此，本研究認為NaCl脅迫下C.morcroftii愈傷組織中Ca2+可能作為下游信號被cGMP激活.

(a)Na+含量

(b)K+含量

(c)Na+/K+圖4 8-Br-cGMP、Ly83583和EGTA對DC和SC愈傷組織鹽脅迫下元素比的影響

圖5 DC及SC愈傷組織內源cGMP的含量

2.5 cGMP誘導DC和SC愈傷組織中PM H+- ATPase的活性

本研究發(fā)現(xiàn)8-Br-cGMP在鹽脅迫下能夠影響元素比率(圖3)，但是否會影響PM H+-ATPase活性尚不清楚.因此，本文研究了8-Br-cGMP在鹽脅迫下對PM H+-ATPase活性的影響.如圖6所示，在DC愈傷組織中，PM H+-ATPase的活性提高了104.7%，相反，在100 mM NaCl處理時，SC愈傷組織中PM H+-ATPase活性降低了32.4%.在鹽脅迫下，8-Br-cGMP處理可使SC和DC愈傷組織中PM H+-ATPase的活性分別提高82.1%和136.5%.然而，Ly83583使SC和DC愈傷組織中PM H+-ATPase的活性分別降低了25.8%和16.7%.研究還發(fā)現(xiàn)，在DC和SC愈傷組織中，EGTA顯著性降低鹽脅迫下8-Br-cGMP誘導的PM H+-ATPase活性，說明Ca2+在誘導cGMP提高PM H+-ATPase的活性中很關鍵，且是不可或缺的.Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)Ca2+能夠參與cGMP介導的信號通路，從而刺激PM H+-ATPase基因表達.以上研究結果表明，cGMP和Ca2+在調節(jié)DC和SC愈傷組織PM H+-ATPase的活性中起著至關重要的作用.

圖6 8-Br-cGMP、Ly83583和EGTA對鹽脅迫下DC及SC愈傷組織中PM H+-ATPase活性的影響

3 結論

本研究數(shù)據(jù)表明，cGMP(環(huán)鳥甘酸)和Ca2+能夠響應沙生型(DC)愈傷組織耐鹽性的信號網(wǎng)絡，并協(xié)同調節(jié)Na+/K+比率維持離子穩(wěn)態(tài)及PM H+ATPase活性；在此過程中，Ca2+作為cGMP的下游信號調節(jié)PM H+-ATPase活性，為離子跨膜運輸提供驅動力，最終提高C.Moorcroftii愈傷組織耐鹽性；Ca2+在cGMP介導的信號通路中也是一種不可或缺的的物質.

本研究為在鹽堿地苔屬植物的種植以及耐鹽生理機制的研究提供一定的科學依據(jù)，并期望能夠采取相應的策略去利用它們改良鹽堿地以及創(chuàng)造良好的經(jīng)濟效益和社會效益.