高糖脅迫下魯氏接合酵母細胞膜生理應答機制研究

王虎玄， 代春吉， 孫宏民

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

中國是全球蘋果種植面積和產量第一大國，也是世界最大的濃縮蘋果汁生產加工和出口國.然而，由于各種不安全因子引起的質量安全問題導致中國濃縮蘋果汁在國際貿易競爭中面臨嚴峻的挑戰(zhàn).為了消除濃縮蘋果汁中各種不安全因子導致的國際貿易受挫，破解因質量安全不達標引起的大規(guī)模退貨、索賠等難題，進一步促進中國蘋果加工產業(yè)的健康發(fā)展，對中國濃縮蘋果汁產業(yè)面臨的高滲酵母、脂環(huán)酸芽孢桿菌、食源性致病菌、農藥、展青霉素、富馬酸、重金屬等質量安全問題進行深入研究并提出切實可行的控制措施，具有重要的意義[1].其中，高滲酵母作為濃縮蘋果汁產業(yè)中關鍵質量安全因子，已成為確保果蔬質量安全的必檢指標之一，引起相關生產企業(yè)和科研工作者的關注[2,3].

由于濃縮果汁中高濃度糖類物質等能夠顯著增強酵母細胞的高溫耐受性，濃縮蘋果汁生產企業(yè)采用的高溫巴氏殺菌技術并不能徹底控制高滲酵母的污染[4,5].此外，濃縮蘋果汁采用無菌袋包裝，包裝袋內存在一定的氧氣，貯存和運輸溫度為常溫，而常溫及有氧條件都有利于高滲酵母的繁殖和生長[6].作者前期從因質量不達標而被美國大規(guī)模退貨的陜西某大型果汁加工廠生產的濃縮蘋果汁(70 °Brix；pH 3.5)中分離出大量高滲酵母，經鑒定為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)，并證實其能夠在濃縮蘋果汁中生長[5,7].濃縮蘋果汁主要基于高糖(70 °Brix)和酸(pH 3.5)的脅迫壓力維持其微生物穩(wěn)定性.作者前期研究發(fā)現濃縮蘋果汁中高濃度糖是脅迫Z.rouxii生長的主要壓力因子[8].為了能夠在濃縮蘋果汁生產中徹底控制魯氏接合酵母污染，作者前期參與射頻(Radio Frequency，RF)對該菌的殺滅作用研究，結果表明在最優(yōu)工藝條件下該技術并不能徹底殺滅濃縮蘋果汁中的魯氏接合酵母[9].從根本來看，深入理解Z.rouxii耐受高糖脅迫的分子機制，并在此基礎上針對關鍵耐糖因子設計功能干擾措施以消除菌株耐糖性，是徹底控制濃縮蘋果汁生產中該菌污染的有效途徑.

細胞膜作為酵母與外界環(huán)境接觸的屏障，具有維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，確保物質正常運輸的功能.外界環(huán)境脅迫會改變細胞膜脂質組成，影響膜ATPase活性，引起膜通透性、完整性等生理特性發(fā)生變化，從而顯著增強菌株耐壓性[10]，表明酵母細胞膜與酵母耐壓性密切相關，那么高糖脅迫下Z.rouxii細胞膜會產生怎樣的生理應答以提高菌株耐糖性，目前尚不清楚.

基于此，本研究在前期相關研究基礎上，以無碳源YPD培養(yǎng)液為基礎培養(yǎng)基，將來源于濃縮蘋果汁的魯氏接合酵母及其標準菌接種于糖濃度分別為2%、40%、70%(w/v)的YPD液體中.觀察在不同糖濃度下培養(yǎng)的酵母菌落形態(tài)；使用掃描電鏡觀察酵母細胞的形態(tài)，測定細胞大?。粶y定不同糖濃度培養(yǎng)下菌液相對電導率變化、菌液核酸含量變化以及細胞膜ATPase活力變化；通過以上研究探究高糖脅迫下Z.rouxii細胞膜生理應答特性.研究結果對于建立濃縮蘋果汁生產中魯氏接合酵母污染控制措施具有重要的理論價值.

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與培養(yǎng)基試劑

1.1.1 試驗菌株

魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)分離菌株LB，分離于濃縮蘋果汁；

魯氏接合酵母標準菌株ATCC 2623，購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC).

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

YPD培養(yǎng)基：10 g酵母浸粉，20 g蛋白胨，20 g葡萄糖，1 000 mL蒸餾水；如配制固體培養(yǎng)基，加入瓊脂 20 g.

2%糖濃度培養(yǎng)基：10 g酵母浸粉，20 g蛋白胨，10 g葡萄糖，10 g果糖，1 000 mL蒸餾水；如配制固體培養(yǎng)基，加入瓊脂 20 g.

40%糖濃度培養(yǎng)基：10 g酵母浸粉，20 g蛋白胨，200 g葡萄糖，200 g果糖，1 000 mL蒸餾水；如配制固體培養(yǎng)基，加入瓊脂 20 g.

70%糖濃度培養(yǎng)基：10 g酵母浸粉，20 g蛋白胨，350 g葡萄糖，350 g果糖，1 000 mL蒸餾水；如配制固體培養(yǎng)基，加入瓊脂 20 g.

生理鹽水：氯化鈉 9.0 g，少量蒸餾水溶解后補加蒸餾水至1 000 mL.

5%葡萄糖溶液：稱取50 g葡萄糖，用蒸餾水定容至1 000 mL；

磷酸緩沖液(pH=7.4)：甲液(0.2 M NaH2PO4·H2O)：稱取2.76 g磷酸二氫鈉溶于蒸餾水，稀釋定容至100 mL.乙液(0.2 M Na2HPO4·H2O)：稱取5.36 g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水，稀釋定容至100 mL.取A液19.00 mL，B液81.00 mL混合，測定混合液pH.

磷酸緩沖液(pH=7.2)：甲液(0.05 M Na2HPO4)：稱取7.099 g磷酸氫二鈉溶于蒸餾水，稀釋定容至1 000 mL.乙液(0.05 M KH2PO4)：稱取6.803 g磷酸二氫鉀溶于蒸餾水，稀釋定容至1 000 mL.取甲液70.50 mL，乙液29.50 mL混合，測定混合液pH.

ATPase試劑盒購買自南京建成生物工程研究所.

以上試劑均為國產分析純.

1.2 主要儀器與設備

本研究所用主要儀器與設備如表1所示.

表1 主要儀器與設備

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗菌株活化

將凍存于-30 ℃的魯氏接合酵母LB和ATCC 2623常溫解凍后接種到YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃下搖床(120 rpm)培養(yǎng)48 h.重復上述步驟再次培養(yǎng)活化.各吸取1 mL菌液梯度稀釋后，取合適濃度菌液200μL接種到YPD固體培養(yǎng)基上，并用涂布棒將菌液涂布均勻， 28 ℃培養(yǎng)48～60 h.定期觀察菌株生長情況，菌落是否清晰，是否有雜菌污染等.挑取符合要求單菌落，接種于YPD斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48～60 h后于4 ℃條件下保存，備用.

1.3.2 高糖脅迫下菌落形態(tài)觀察

將魯氏接合酵母ATCC 2623和LB分別接種在2%、40%和70%糖濃度的固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72～96 h.觀察不同糖濃度下菌株菌落形態(tài)，并進行拍照.

1.3.3 高糖脅迫下細胞表面形態(tài)觀察及細胞大小測定

采用場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡(SEM)觀察高糖脅迫下魯氏接合酵母細胞表面形態(tài)變化.試驗菌株分別在2%、40% 和70%(w/v)糖濃度條件下培至穩(wěn)定期，離心(5 000 × g,10 min) 收集菌株細胞，去離子水沖洗后重懸于2.5%戊二醛溶液中過夜固定.離心(5 000 × g,10 min) 收集細胞，重懸于磷酸緩沖液(pH 7.2)洗滌后收集細胞，重復洗滌三次.分別用濃度為30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%(v/v)的乙醇溶液對菌株細胞進行梯度脫水處理，脫水時間30 min，為充分脫水需進行渦旋混勻.脫水后離心(6 000 × g,10 min) 收集細胞.采用CO2臨界點干燥法處理菌株細胞后進行噴金，然后通過SEM來觀察細胞形態(tài)并進行細胞大小的測定.在顯微鏡視野，從每個菌株細胞樣本中任意選取15個不同的視野進行觀察.在每個選定的視野中任意選取5～10個細胞進行測定.

利用掃描電鏡中的測量工具對酵母細胞的長度(l)、寬度(w)數據進行測量.在測量時，根據酵母細胞的特點將酵母細胞的形狀看成一個橢圓球體.并測得細胞的長軸(a=l/2)、短軸(b=w/2)，依據公式(1)、(2)計算菌株細胞表面積(S)及體積(V):

S=4πb[sin45 °(a-b)+b]

(1)

V=4πab2/3

(2)

1.3.4 高糖脅迫下細胞膜通透性測定

參考Wen Rui Diao等[11]的方法進行高糖脅迫下菌株細胞膜通透性的測定.以40%(w/v)濃度糖脅迫為例說明細胞膜測定方法.試驗菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃過夜培養(yǎng)后離心收集細胞(5 000 × g,10 min).用40%(w/v)葡萄糖溶液清洗菌體，直至菌體相對電導率與40%(w/v)葡萄糖溶液的相對電導率相同，此菌稱之為等滲菌.等滲菌進行沸水浴5 min，冷卻至室溫，測定其相對電導率，記為L0.同時測定40%葡萄糖溶液相對電導率，記為L1.將試驗菌株分別接種于40%葡萄糖溶液中，隔1 h測定其相對電導率，記為L2.

相對電導率(%)=100×(L2-L1)/L0

(3)

依據上述方法，測定70%糖濃度脅迫下試驗菌株的L0、L1和L2，計算其相對電導率.

1.3.5 高糖脅迫下細胞膜完整性測定

參考張璞瑜[12]的方法進行高糖脅迫下菌株細胞膜完整性測定.試驗菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃過夜培養(yǎng)后離心收集細胞(5 000 × g,10 min).細胞重懸于PBS緩沖溶液(pH 7.4)清洗3次后分別接種于2%、40%和70%糖濃度培養(yǎng)基中.以空白培養(yǎng)液為參比，每隔2 h取樣進行預處理后用紫外可見分光光度計在260 nm處測定其吸光度值.

1.3.6 高糖脅迫下細胞膜ATPase活力測定

離心收集(5 000 × g,10 min)分別在2%、40% 和70%糖濃度條件下培養(yǎng)的試驗菌株細胞.菌體置于研缽中，加入適量液氮后快速研磨至糊狀.生理鹽水(0.9%)定容糊狀菌體至10 mL并充分混勻后4 ℃離心(9 000×g，10 min)收集上清液，此上清液即為粗酶液.之后按照ATP酶試劑盒說明書進行ATP酶活力測定.ATP酶可以將ATP水解生成ADP和無機磷，通過測定粗酶液中無機磷的含量，可以判斷其細胞膜上ATP活力的高低.將每克菌液分解ATP產生1μmol無機磷的量作為1個ATP酶活力單位.計算公式如(4)所示:

ATPase活力=(測定OD值-對照OD值)/標準OD值×標準品濃度(1μmol / mL)×反應體系中樣本稀釋倍數×6/待測樣本蛋白濃度

(4)

1.3.7 數據處理

上述試驗均重復3次，試驗數據以均值±標準差表示.采用SPSS軟件對試驗數據進行方差分析及多重比較檢驗(p<0.05， 鄧肯氏檢驗).

2 結果與討論

2.1 高糖脅迫下Z.rouxii菌落形態(tài)

高糖脅迫下試驗菌株菌落形態(tài)如圖1所示.可以看出：隨著培養(yǎng)基糖濃度增加,試驗菌株菌落形態(tài)發(fā)生了明顯變化，主要表現為菌落大小和透明度的差異.在低濃度糖(2%，w/v)條件下，試驗菌株菌落呈乳白色，不透明，大小適中；隨著糖濃度增加(40%～70%，w/v),試驗菌株菌落透明度增加，可以透射培養(yǎng)基顏色而呈微黃色，體積相對偏小.根據這一結果初步推測高糖脅迫下Z.rouxii細胞產生了生理應答，細胞代謝網絡發(fā)生動態(tài)調整以抵御外界脅迫，維持正常生理代謝.Z.rouxii從自然環(huán)境到污染濃縮蘋果汁等高糖食品的過程中，必須克服高糖脅迫壓力才能導致食品腐敗變質.

目前，已報道的Z.rouxii耐受高糖脅迫的分子機制主要包括：轉運蛋白、相容性溶質、信號轉導調控等[13].本試驗發(fā)現隨著糖脅迫強度的增加，Z.rouxii菌落透明度增加，推測其可能的原因是在高糖脅迫下細胞通過調節(jié)代謝途徑促使胞內積累了大量的甘油、山梨醇、海藻多糖等相容性溶質以緩解胞外高滲透壓，從而引起菌落透明度增加.Du?kov等[14]的研究發(fā)現Z.rouxii的Stl、Ffz、Fsy基因編碼能夠介導主動吸收胞外甘油或果糖的轉運蛋白，從而提高細胞的耐糖性.Z.rouxii的Gpd、Gpp、Dak、Gcy基因編碼催化甘油合成的酶，Fps基因編碼甘油轉運通道蛋白，細胞對上述基因表達的調控可使胞內累積甘油來抵御高糖脅迫[15].Z.rouxii也可合成并累積海藻糖、阿拉伯醇、甘露醇等相容性溶質來增強細胞的耐受性[16].由此可見，胞內相容性溶質的積累在Z.rouxii抵御外界高糖脅迫中具有重要作用.

(a)2%糖+LB (b)40%糖+LB (c)70%糖+LB (d)2%糖+ATCC 2623 (e)40%糖+ATCC 2623 (f)70%糖+ATCC 2623圖1 不同糖濃度脅迫下Z.rouxii菌落形態(tài)

2.2 高糖脅迫下Z.rouxii細胞形態(tài)及大小

高糖脅迫下試驗菌株細胞形態(tài)如圖2所示.可以看出：隨著糖脅迫強度增加，細胞由橢圓趨向圓形，細胞表面出現一定褶皺，并且細胞趨于聚集.研究表明外界脅迫因素(高酸、高滲、高溫、高醇等)會引起酵母一些生理特性的變化，從而在一定程度上影響酵母細胞的形狀和聚集性.在外界不良環(huán)境脅迫下，微生物細胞代謝活性受到一定抑制，引起甘露糖合成酶活力下降，造成細胞壁中甘露糖含量減少，細胞壁不能正常發(fā)揮功能.但微生物細胞為了維持正常的生理活動，啟動HOG和CWI信號傳導途徑合成大量葡聚糖來修復細胞壁，導致細胞壁層的增厚.細胞壁層的增厚引起細胞形態(tài)發(fā)生變化，由橢圓形逐漸趨于圓形.因此，當酵母菌處于不良外界環(huán)境中時，通過調控代謝網絡合成大量葡聚糖使細胞壁增厚，從而阻止外界大分子自由進入細胞，是酵母菌進行自我保護的一種代謝調控能力的體現[17].在外界脅迫因素作用下，酵母菌胞壁蛋白的糖基化修飾受到抑制，導致大量蛋白暴露于細胞表面，弱化了細胞表面張力，最終引起酵母菌趨于聚集[18].

(a)2%糖+LB (b)40%糖+LB (c)70%糖+LB (d)2%糖+ATCC 2623 (e)40%糖+ATCC 2623 (f)70%糖+ATCC 2623圖2 不同糖濃度脅迫下的Z.rouxii細胞形態(tài)(放大5 000倍)

對試驗菌株的表面積和體積進行計算，結果如表2所示.由表2可以看出，隨著糖濃度不斷增大，細胞表面積和體積顯著減小(p< 0.05)，糖濃度為70%時，細胞表面積和體積最小.說明高糖脅迫對Z.rouxii細胞生長具有抑制作用.此外，細胞表面出現一定褶皺，一定程度上引起細胞內容物外流也對細胞表面積和體積變化產生一定影響.

表2 不同糖濃度脅迫下Z.rouxii細胞表面積與體積

2.3 高糖脅迫下Z.rouxii細胞膜通透性

從圖3可以看出，將試驗菌株分別接種于40%和70%(w/v)糖濃度培養(yǎng)基中，菌液的相對電導率隨著脅迫時間會顯著升高(p<0.05)，之后趨于平穩(wěn).這可能是由于Z.rouxii細胞對高糖脅迫產生完全應答需要一定時間，在此其間酵母細胞尚不能適應高糖脅迫環(huán)境，導致細胞膜的屏障作用減弱，通透性增加，引發(fā)包括電解質在內的細胞內容物外泄，從而造成菌液相對電導率逐漸增大.隨著高糖脅迫時間的延長，Z.rouxii細胞逐漸完成細胞應答過程，適應了高糖脅迫環(huán)境，通過調整細胞膜組成與結構恢復了膜通透性，胞內電解質停止外泄，因此菌液相對電導率趨于平穩(wěn).酵母細胞膜通透性與酵母抵抗環(huán)境脅迫的能力密切相關.通透性越大，抗逆能力越弱；通透性降低，細胞滲透屏障增強，可以確保細胞膜的結構和功能完整性，從而提高酵母細胞抵抗環(huán)境脅迫的能力.酵母細胞膜通透性與膜脂結構組成有關.在外界壓力因子脅迫下，酵母細胞會通過脂肪酸異構化方式調節(jié)細胞膜中順、反式脂肪酸比例，逐步恢復細胞膜通透性[10].麥角固醇對于恢復酵母細胞膜通透性也具有重要作用，其可在細胞膜上形成屏障，阻礙胞內外物質自由進出細胞[10].此外，70%糖濃度下菌液相對電導率顯著高于40%糖濃度下的相對電導率(p<0.05)，說明糖濃度越高，對細胞的脅迫作用越強，細胞在高糖濃度的脅迫作用下，導致電解質在短時間內大量外泄.

(a)40%(w/v)糖脅迫下LB菌液電導率

(b)70%(w/v)糖脅迫下LB菌液電導率

(c)40%(w/v)糖脅迫下ATCC2623菌液電導率

(d)70%(w/v)糖脅迫下ATCC2623菌液電導率圖3 高濃度糖脅迫下Z.rouxii菌液電導率(不同上標小寫字母表示具有顯著差異(p<0.05鄧肯氏檢驗))

2.4 高糖脅迫下Z.rouxii膜完整性

從圖4可以看出，試驗菌株在40%與70%糖脅迫下，菌液中核酸吸光度隨著脅迫時間的延長顯著增加，然后逐漸降低并趨于穩(wěn)定(p<0.05).這可能是由于高濃度糖脅迫下，Z.rouxii菌體細胞膜受到一定損害，導致核酸等大分子從胞內流出，從而引發(fā)菌液中核酸吸光度增大.隨著Z.rouxii細胞逐漸適應高糖環(huán)境，細胞膜組成和結構經過動態(tài)調節(jié)逐漸恢復完整性，胞內核酸等大分子停止外流，同時由于菌液酸堿度波動以及酵母細胞可能分泌少量胞外酶等原因導致菌液中部分核酸分子發(fā)生水解或降解，因此菌液中核酸吸光度逐漸降低并趨于穩(wěn)定.

研究表明環(huán)境壓力因子脅迫對微生物細胞膜完整性的影響主要表現在對疏水基相互作用的破壞.疏水基相互作用對于維持細胞膜穩(wěn)態(tài)具有重要作用,環(huán)境壓力因子作用于細胞膜后主要對細胞膜中由長鏈烴基組分依靠疏水基相互作用形成的疏水核心進行破壞，造成該疏水核心極性化，從而屏蔽該核心區(qū)域對極性物質進出細胞的滲透屏障，削弱細胞膜的完整性，引發(fā)細細胞內容物外泄[19].

(a)40%(w/v)糖脅迫下LB菌液核酸吸光度

(b)70%(w/v)糖脅迫下LB菌液核酸吸光度

(c)40%(w/v)糖脅迫下ATCC2623菌液核酸吸光度

(d)70%(w/v)糖脅迫下ATCC2623菌液核酸吸光度圖4 高濃度糖脅迫下Z.rouxii菌液核酸吸光度(不同上標小寫字母表示具有顯著差異(p<0.05，鄧肯氏檢驗))

2.5 高糖脅迫下Z.rouxii細胞膜ATPase活力

高糖脅迫對Z.rouxii細胞膜ATPase活性的影響如表3所示.從表3可以看出，在高糖脅迫下， 試驗菌株細胞膜 H+-ATPase、 Na+、K+-ATPase和Ca2+、Mg2+-ATPase酶活力均顯著升高(p<0.05).這可能是由于一定濃度的糖脅迫下，Z.rouxii細胞啟動應答響應，在一定時間內通過增強膜ATPase活性來抵御高濃度糖的脅迫，是酵母細胞自身應激反應的一種體現.

表3 糖脅迫下Z.rouxii細胞膜ATPase活力

ATP酶對于微生物細胞的生理代謝非常重要，其在細胞膜和細胞器膜上存在廣泛，參與多種生理代謝活動.H+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶是細胞膜上主要的ATP酶，主要通過調節(jié)細胞內外滲透壓平衡和細胞膜結構與功能的完整性維持細胞正常的生理活性[20].微生物細胞受到環(huán)境壓力因子脅迫時，細胞產生應答，胞膜上ATP 酶活性會產生變化.細胞膜H+-ATPase活性升高，可以弱化脅迫因子對微生物細胞跨膜質子流的影響，從而強化菌體抗逆性[21].細胞膜Na+，K+-ATPase 活性升高，通過逆濃度將胞外K+轉運至胞內并將胞內Na+轉運至胞外來調節(jié)細胞內外滲透壓平衡[20].Ca2+，Mg2+-ATPase是微生物細胞維持胞內Ca2+平衡的一種膜轉運蛋白，其活性升高可將由于受到外界壓力脅迫而產生的高濃度胞內Ca2+轉運出胞外，從而維持細胞的正常生理代謝[20].

3 結論

本研究結果表明，高糖脅迫下Z.rouxii細胞膜發(fā)生一系列生理應答以適應高糖環(huán)境，主要表現為：菌落透明度增加，菌體細胞一定程度萎縮，體積變?。患毎ねㄍ感韵仍龃蠛鬁p小最終趨于平穩(wěn)；細胞膜完整性先降低后增加最終也趨于穩(wěn)定；細胞膜H+-ATPase、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活力升高，說明高糖脅迫會影響Z.rouxii膜ATPase活力，引起膜通透性、完整性等生理特性發(fā)生變化，從而導致細胞耐糖性發(fā)生變化.

本研究結果有助于深入理解Z.rouxii耐受高糖脅迫的細胞膜應答機制，為后續(xù)有針對性地建立功能干預措施抑制細胞膜生理應答進程從而降低Z.rouxii耐糖性，進而弱化其污染能力，實現有效控制濃縮蘋果汁等高糖食品生產中Z.rouxii污染提供基礎理論支持.