13C6-酪氨酸標(biāo)記的蛋清溶菌酶的表達(dá)及NMR測定

王瑞英,余 飛,2,劉萬卉,2

(1.煙臺(tái)大學(xué)新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心、分子藥理和藥物評價(jià)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(煙臺(tái)大學(xué)),山東 煙臺(tái) 264005;2.綠葉制藥集團(tuán)有限公司,山東 煙臺(tái) 264003)

核磁共振波譜(Nuclear magnetic resonance,NMR)技術(shù)是少數(shù)幾種能在原子尺度上對蛋白質(zhì)的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征的技術(shù)之一,目前能對分子質(zhì)量高達(dá)幾十萬的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征[1-3]．采用15N和13C全同位素標(biāo)記中等大小的蛋白質(zhì),NMR表征其結(jié)構(gòu)并收錄在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)里[4-5]．對分子質(zhì)量大的蛋白質(zhì)(>40 kU),因NMR信號重疊及峰寬增加,全同位素標(biāo)記的樣品已不能滿足NMR表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的要求．另外,某些蛋白質(zhì)很難獲得全同位素標(biāo)記的樣品,且其標(biāo)記耗費(fèi)昂貴．為了克服全同位素標(biāo)記的難題,發(fā)展了一系列的蛋白標(biāo)記技術(shù),其中包括選擇性標(biāo)記技術(shù),即僅對一到兩種氨基酸進(jìn)行標(biāo)記[6-7]．選擇性標(biāo)記可以大幅度提高蛋白質(zhì)中特定氨基酸的信號,達(dá)到簡化譜圖的目的．

核磁共振研究中所利用的同位素標(biāo)記蛋白大多是在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中得到的．大腸桿菌遺傳背景清楚、操作簡單且表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其他基因表達(dá)系統(tǒng)[8-10],是現(xiàn)階段最常用的表達(dá)系統(tǒng),也是獲得同位素標(biāo)記蛋白最為經(jīng)濟(jì)的一種表達(dá)系統(tǒng)[11-12]．但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)有其局限性,表達(dá)產(chǎn)物有時(shí)會(huì)形成不溶性的聚積物沉淀,稱為包涵體．包涵體蛋白通常沒有蛋白活性,需要進(jìn)行變復(fù)性處理,折疊成天然結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[13-14]．

蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme,HEL)的酶學(xué)結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)以及酶蛋白基因結(jié)構(gòu)都已經(jīng)研究的很清楚,因此本文作為模型蛋白進(jìn)行基礎(chǔ)研究．已知HEL是由129個(gè)氨基酸殘基組成的一條多肽鏈,分子質(zhì)量為14.3 kU,含有4對二硫鍵,空間結(jié)構(gòu)為較緊密的橢球形[15]．酪氨酸(Tyr)為芳香族氨基酸,常位于蛋白質(zhì)的疏水核心,且位于配基結(jié)合的界面上,其殘基側(cè)鏈上空間約束對于大部分蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的研究具有非常重要的價(jià)值．HEL含有3個(gè)Tyr,對其芳香環(huán)的13C進(jìn)行標(biāo)記,可以簡化核磁譜,便于重疊信號的區(qū)分,從而對酪氨酸的信號進(jìn)行指認(rèn)[13]．本研究利用蛋清溶菌酶對酪氨酸的選擇性標(biāo)記進(jìn)行了方法優(yōu)化,其中包括誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)劑(IPTG)的誘導(dǎo)濃度、可溶性表達(dá)等,然后經(jīng)過分離純化,得到高純度的目標(biāo)蛋白,為進(jìn)一步制備選擇性標(biāo)記的蛋白以及利用核磁研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能奠定基礎(chǔ)．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株 大腸桿菌Ε.coliBL21(DE3)購自上?？蒲猩锟萍加邢薰?HEL-pET15b(含6個(gè)His標(biāo)簽,酶切位點(diǎn)為NdeⅠ和XhoⅠ)重組質(zhì)粒(圖1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成．

圖1 重組質(zhì)粒HEL-pET15b圖譜

1.1.2 試劑 酵母粉、胰蛋白胨、瓊脂(OXOID)、氯化鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、M9基礎(chǔ)鹽溶液2X(Thermo)、氨芐青霉素(北京全式金生物有限公司)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,翊圣生物)、蛋清溶菌酶、DTT、氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、鹽酸胍、葡萄糖、氯化鈣、鹽酸鎂(Sigma)、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(Thermo)、13C6-酪氨酸(CIL)．

1.1.3 儀器 電子天平(METTLER TOLEDO)、高壓滅菌鍋(ZEALWAY)、恒溫?fù)u床(上海知楚)、培養(yǎng)箱(上海一恒科技)、高速低溫離心機(jī)(Thermo)、電泳系統(tǒng)(Thermo)、凝膠成像儀(Bio-Rad)、核磁共振儀(Bruck 600 MHz)、紫外-可見分光光度計(jì)(Thermo NanoDrop 2000)．

1.2 單菌落的培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)

將表達(dá)載體pET-HEL轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Ε.coliBL21(DE3)中,得到攜帶有pET-HEL的BL21(pET-HEL)菌株,在含100 μg/mL Ampicillin LB(LB/Amp100)固體培養(yǎng)基平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)過夜．挑取單菌落接種至LB/Amp100液體培養(yǎng)基,37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜,然后按照1∶20比例接種至M9培養(yǎng)基,37 ℃、200 r/min擴(kuò)增培養(yǎng),直到吸光度A600為0.6～0.8．用于后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)基的選擇．

1.3 蛋白質(zhì)表達(dá)條件的優(yōu)化

1.3.1 誘導(dǎo)溫度的選擇 取“1.2”所得菌液3管,每管5 mL,加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L,分別于25 ℃、30 ℃、37 ℃,200 r/min誘導(dǎo)6 h,各收集菌液1 mL,離心,棄上清,加入100 μL Loading Buffer,5 μL DTT,80 ℃煮沸5 min,取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE檢測．

1.3.2 誘導(dǎo)劑濃度的選擇 取“1.2”所得菌液6管,每管5 mL,加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L,于37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,各收集菌液1 mL,按照“1.3.1”方法進(jìn)行樣品處理與分析．

1.3.3 誘導(dǎo)時(shí)間的選擇 取“1.2”所得菌液1管15 mL,加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L,于37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng),分別于0、2、4、6、8、10、20 h取樣1 mL,按照“1.3.1”方法進(jìn)行樣品處理與分析．

1.3.4 HEL的可溶性分析 取誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌液10 mL,5 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀反復(fù)凍融幾次,加入2 mL裂解液懸浮,超聲裂解,4 ℃、12 000 r/min離心10 min,分別收集上清和沉淀,加入Loading Buffer與DTT,各取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析．

1.4 HEL的大量培養(yǎng)與分離純化

1.4.1 HEL的大量表達(dá)以及包涵體的變性與復(fù)性 在選定的蛋白質(zhì)表達(dá)條件下,培養(yǎng)菌液1 L,4 ℃、4 500 r/min離心30 min收集菌體,加入50 mL PBS懸浮沉淀,反復(fù)凍融3次,離心,棄上清,加入50 mL裂解液(PBS緩沖液,pH值7.0),超聲裂解,離心,棄上清,收集沉淀．將包涵體沉淀用50 mL變性溶液(20 mmol/L Tris,50 mmol/L NaCl,6 mol/L GuHCl,10 mmol/L DTT,pH值7.0)溶解,室溫放置2 h;然后緩慢滴加至500 mL復(fù)性溶液(50 mmol/L Tris,5 mmol/L GSH,0.5 mmol/L GSSG,pH值7.0),攪拌,過夜,離心,取上清,0.45 μm微孔濾膜過濾．

1.4.2 Ni柱親和層析分離純化HEL 取復(fù)性溶液流穿2 mL Ni柱親和層析液,分別用洗滌液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,2 mmol/L咪唑,pH值8.0)洗滌3～4次,洗脫液(50 mmol/L NaH2PO4,300 mmol/L NaCl,50 mmol/L咪唑)洗脫6～8次,取15 μL進(jìn)行SDS-PAGE分析．

1.5 選擇性標(biāo)記蛋白樣品的表達(dá)

按照上述優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行大量表達(dá)．1∶20轉(zhuǎn)至1 L的M9培養(yǎng)基時(shí),加入100 mg的13C6-酪氨酸與50 mg其他19種未標(biāo)記的氨基酸進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),至吸光度A600為0.6～0.8時(shí)加入0.4 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)8 h,然后按照上述變復(fù)性方法與分離純化條件得到選擇性標(biāo)記酪氨酸的蛋清溶菌酶．Ni柱純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行超濾(3 000 MW),然后用紫外分光光度計(jì)測定蛋白濃度．

1.6 選擇性標(biāo)記HEL的NMR測定分析

1.6.1 NMR樣品的制備 將所得到的蛋白溶液置換至500 μL的氘代乙酸鹽緩沖溶液(pH值3.6)中,然后轉(zhuǎn)移至5 mmol/L的核磁管中．另取5 mg自然豐度的蛋清溶菌酶溶于500 μL的氘代乙酸鹽緩沖液(pH值3.6),轉(zhuǎn)至5 mmol/L的核磁管中．

1.6.2 測定NMR譜圖 采用Bruker 600MHz 核磁共振波譜儀測定,儀器探頭為5 mmol/L超低溫探頭,進(jìn)行1H-13C HSQC譜圖測定．設(shè)定的HSQC測定條件為:測定溫度為25 ℃、T1掃描次數(shù)scan為32次,increment為128次．

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化

2.1.1 誘導(dǎo)溫度對蛋白表達(dá)的影響 質(zhì)粒pET-15b選用的酶切位點(diǎn)為NdeⅠ和XhoⅠ,構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)含有6個(gè)his標(biāo)簽便于后續(xù)純化,故pET-HEL誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白分子質(zhì)量約為16.61 kU,經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)后可見目標(biāo)蛋白的條帶．培養(yǎng)溫度在25～37 ℃的范圍內(nèi),37 ℃蛋白表達(dá)量相對最高,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用37 ℃進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)(圖2)．

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker; 1.25 ℃; 2.30 ℃; 3.37 ℃

Fig.2 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different tem-eratures

2.1.2 誘導(dǎo)濃度對蛋白表達(dá)的影響 誘導(dǎo)劑IPTG濃度在0～1.0 mmol/L范圍內(nèi),蛋白表達(dá)量在0.8 mmol/L時(shí)降低,0.2～0.6 mmol/L之間差別不大,選取中間值0.4 mmol/L作為誘導(dǎo)濃度(圖3)．

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker; 1—6為誘導(dǎo)濃度0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol·L-1表達(dá)組

圖3 不同誘導(dǎo)濃度下HEL表達(dá)的SDS-PAGE

Fig.3 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different con-centration of inducer

2.1.3 誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白表達(dá)的影響 HEL蛋白表達(dá)量開始隨時(shí)間延長而增加,到8 h后表達(dá)量差異不明顯(圖4),考慮到時(shí)間成本,后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選擇誘導(dǎo)表達(dá)8 h．

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker; 1—7為誘導(dǎo)時(shí)間0、2、4、6、8、10、20 h表達(dá)組

Fig.4 SDS-PAGE pattern of HEL expression at different time

2.2 HEL的可溶性分析

將菌體超聲上清與沉淀進(jìn)行SDS-PAGE測定,轉(zhuǎn)化菌經(jīng)裂解液處理之后,上清中沒有目的蛋白條帶,而在沉淀中出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶,提示表達(dá)HEL主要是以包涵體形式進(jìn)行表達(dá),與文獻(xiàn)一致[16]．說明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)折疊不正確,因此需要進(jìn)行變復(fù)性處理(圖5)．

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker; H.天然HEL； 1.誘導(dǎo)前； 2.誘導(dǎo)后; 3.誘導(dǎo)后； 4.超聲上清； 5.超聲沉淀

圖5 可溶性分析的SDS-PAGE

Fig.5 SDS-PAGE pattern for soluble analysis

2.3 HEL的大量表達(dá)與分離純化

按照前期的優(yōu)化條件擴(kuò)大表達(dá)后得到菌體,超聲破碎獲得包涵體,經(jīng)過鹽酸胍變性與稀釋復(fù)性之后,將復(fù)性溶液過Ni柱進(jìn)行純化,然后進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測,測定結(jié)果顯示:變性上清中含有目標(biāo)蛋白,Ni柱純化的洗脫液的SDS-PAGE結(jié)果顯示純化后得到單一條帶的蛋白帶,而在變性后離心沉淀以及流穿與洗滌液中都沒有目標(biāo)蛋白條帶的出現(xiàn)(圖6).

M.蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker; H.天然HEL； 1.變性上清； 2.變性沉淀; 3.復(fù)性上清； 4.流穿液； 5.洗滌液 6.洗脫液

圖6 Ni柱純化的SDS-PAGE

Fig.6 SDS-PAGE pattern of purified protein through Ni col-umn

2.4 蛋白收率

紫外分光光度法測得蛋白收率為3 mg/L培養(yǎng)基．

2.5 天然與標(biāo)記狀態(tài)下HEL的NMR譜圖

天然與標(biāo)記狀態(tài)下HEL的HSQC全譜如圖7所示,圖譜中的橫縱坐標(biāo)一致,圖7A為天然狀態(tài)下HEL的HSQC譜,圖7B為標(biāo)記狀態(tài)下HEL的HSQC譜,a部分為烷烴區(qū)域;b部分為芳香環(huán)區(qū)域．由圖7可知,自然豐度下HEL的信號重疊較為嚴(yán)重,標(biāo)記后主鏈區(qū)(A烷烴區(qū)域)信號明顯減少,芳香環(huán)部分的信號只有標(biāo)記氨基酸的信號．

圖7 天然與標(biāo)記狀態(tài)下HEL的HSQC全譜

圖8為天然與選擇性標(biāo)記下HEL的HSQC譜圖的芳香環(huán)部分譜圖．圖中信號主要是酪氨酸的信號,其中c部分為溶劑與緩沖鹽溶液的信號．經(jīng)過信號歸屬,a為酪氨酸α部分的CH信號,b為酪氨酸β部分的CH信號．

圖8 天然與標(biāo)記狀態(tài)下HEL的HSQC譜圖芳香環(huán)部分

Fig.8 The part of aromatic rings of HSQC spectrum of HEL in natural and labeled state

3 結(jié) 論

通過對蛋清溶菌酶(HEL)中酪氨酸(Tyr)進(jìn)行選擇性標(biāo)記,闡明了選擇性標(biāo)記HEL的表達(dá)方法,并將利用此法得到的標(biāo)記的蛋清溶菌酶與天然的蛋清溶菌酶進(jìn)行HSQC譜圖的比較,結(jié)果表明標(biāo)記的蛋清溶菌酶簡化了核磁譜圖,簡化后Tyr的信號更加清晰,使得核磁信號指認(rèn)困難的問題得以解決．為將來蛋白質(zhì)的特殊標(biāo)記提供了指導(dǎo)意義,同時(shí)為未來蛋白質(zhì)核磁研究中的特殊標(biāo)記樣品的制備提供了節(jié)約成本與人力的借鑒意義．