淫羊藿總黃酮清除DPPH自由基的紫外-可見吸收光譜研究

姚金龍

摘要：目的? 研究淫羊藿總黃酮的提取、分離及純化工藝，建立紫外-可見吸收光譜滴定法，評(píng)價(jià)淫羊藿總黃酮清除DPPH自由基的抗氧化活性。方法? 通過保持其它條件不變，分別考察浸提溫度、料液比和乙醇濃度對(duì)提取液中淫羊藿總黃酮含量的影響，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，提取溫度60 ℃～80 ℃，乙醇濃度50%～70%，料液比1：35～1：15，做3次平行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化淫羊藿總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果? 溫度70 ℃、60%乙醇濃度和1：25料液比是最優(yōu)提取工藝條件，淫羊藿精提液中總黃酮質(zhì)量濃度為10.15 μg/ml，含量為31.72%。光譜滴定法結(jié)果表明，淫羊藿總黃酮的質(zhì)量濃度≥0.002 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)79.17%。結(jié)論? 淫羊藿總黃酮對(duì)DPPH自由基有很好的清除能力，抗氧化活性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：淫羊藿總黃酮;紫外-可見吸收光譜;DPPH自由基;抗氧化

中圖分類號(hào)：R285;TS201.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.053

文章編號(hào)：1006-1959（2020）20-0164-03

Study on the UV-Vis Absorption Spectra of Scavenging DPPH Free Radicals

by Total Flavonoids of Epimedium

YAO Jin-long

（Department of Pharmaceutical Engineering，Jiangxi Medical School，Nanchang 330200，Jiangxi，China）

Abstract：Objective? To study the extraction， separation and purification process of total flavonoids of epimedium， and establish a UV-Vis absorption spectrometric titration method to evaluate the antioxidant activity of total flavonoids of epimedium in scavenging DPPH free radicals.Methods? By keeping other conditions unchanged， the effects of extraction temperature， material-to-liquid ratio and ethanol concentration on the total flavonoids content of epimedium in the extract were investigated respectively. An orthogonal experiment with three factors and three levels was designed， and the extraction temperature was 60 ℃～80 ℃，the ethanol concentration is 50%～70%， the material-liquid ratio is 1：35～1：15， three parallel experiments are performed to optimize the optimal extraction process conditions of the total flavonoids of epimedium.Results? Temperature 70 ℃， 60% ethanol concentration and 1：25 solid-liquid ratio were the optimal extraction conditions. The mass concentration of total flavonoids of epimedium extract was 10.15 μg/ml and the content was 31.72%. The results of spectrometric titration showed that when the mass concentration of total flavonoids of epimedium ≥ 0.002 mg/ml， the clearance rate reached 79.17%.Conclusion? The total flavonoids of epimedium had good scavenging ability to DPPH free radicals and strong antioxidant activity.

Key words：Total flavonoids of epimedium;UV-Vis absorption spectroscopy;DPPH free radical; Antioxidant

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，自由基氧化損傷是引起多種疾病的根源[1]，自由基的進(jìn)攻會(huì)使生命機(jī)體內(nèi)的生物大分子如核酸（DNA、RNA）、酶、蛋白質(zhì)、糖等發(fā)生氧化損傷，并導(dǎo)致生物膜的脂質(zhì)過氧化，對(duì)內(nèi)臟器官、免疫系統(tǒng)的形態(tài)功能產(chǎn)生影響[2]。目前，已有研究證實(shí)羥基自由基OH·能與DNA堿基發(fā)生加成反應(yīng)造成DNA鏈的斷裂和堿基對(duì)的損傷[3];超氧自由基O2-·與生物膜中的磷脂發(fā)生過氧化連鎖反應(yīng)，破壞膜的穩(wěn)定性和完整性，甚至造成細(xì)胞的壞死;過剩的O2-·還會(huì)引起炎癥和腫瘤等[4]。因此，清除自由基[5]的研究已經(jīng)成為了當(dāng)今藥學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮[6]具有優(yōu)越的抗氧化性能，該類化合物可以與自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞處于還原狀態(tài)，抵抗機(jī)體損傷，減少疾病的產(chǎn)生[7]，具有較好的研究前景。但目前淫羊藿總黃酮的提取工藝較多，提取質(zhì)量不一，為其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用造成了困難。為此，本文以淫羊藿總黃酮為研究對(duì)象，采用控制溫度、乙醇濃度和料液比正交實(shí)驗(yàn)方法來優(yōu)化淫羊藿總黃酮的最佳提取工藝條件，旨在為淫羊藿總黃酮的進(jìn)一步研究提供幫助。

1材料與儀器

主要儀器包括分光光度計(jì)、水浴鍋、天平、干燥箱、烘干器等，試劑包括DPPH、淫羊藿苷、乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）等，具體來源情況見表1。

2方法與結(jié)果

2.1淫羊藿總黃酮粗提液的制備? 取淫羊藿葉粉碎，過60目篩，準(zhǔn)確稱取淫羊藿粉末5.0 g，置于250 ml圓底燒瓶中，加入60%乙醇45 ml室溫浸泡輔助浸提30 min，70 ℃回流2次，2 h/次，將提取液抽濾，得總黃酮粗提液。保持其它條件不變，分別考察浸提溫度、料液比和乙醇濃度3個(gè)單因素對(duì)提取液中淫羊藿總黃酮含量的影響，設(shè)計(jì)三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得出淫羊藿總黃酮提取率最高的最佳條件，且每個(gè)單因素做三次平行實(shí)驗(yàn)。以淫羊藿總黃酮提取率為標(biāo)準(zhǔn)，因素水平見表2，最后確定一種最優(yōu)提取工藝，用于淫羊藿總黃酮的提取。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，影響淫羊藿總黃酮提取率的因素大小次序?yàn)椋篊>B>A，B和C因數(shù)的R較大，說明淫羊藿總黃酮提取率主要受乙醇濃度和料液比2個(gè)因素制約，而提取溫度影響不顯著。根據(jù)K值的大小可知，淫羊藿總黃酮提取的最優(yōu)條件為A2B2C2，即微波功率為中低火-中火（300 W），提取溫度為70 ℃，乙醇濃度為60%，料液比為1：25，見表3。

2.2淫羊藿總黃酮的分離純化? 取淫羊藿粗提液，用乙酸乙酯萃取，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空低溫干燥至恒重，得浸膏，稱取適量浸膏加入適量蒸餾水配制成一定濃度的淫羊藿總黃酮精提液備用。

2.3淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 準(zhǔn)確稱取淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用無水乙醇溶液稀釋定容至10 ml，搖勻，得淫羊藿苷儲(chǔ)備液。分別精密吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25 ml的淫羊藿苷儲(chǔ)備液于一系列25 ml的比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白作參比，在λmax=260 nm處測(cè)量其吸光度A，以吸光度對(duì)藿苷溶液的濃度C作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行回歸，得到吸光度A和淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度C的回歸方程：A=14.274C-0.0029（r=0.9989），見圖1。

2.4淫羊藿總黃酮含量的測(cè)定? 按照2.3中的方法定量測(cè)定淫羊藿精提液在不同條件下的吸光度值，對(duì)應(yīng)淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，查找得到測(cè)定液中的總黃酮含量。經(jīng)測(cè)定，淫羊藿精提液中總黃酮質(zhì)量濃度為10.15 μg/ml，含量達(dá)31.72%。

2.5 DPPH體系穩(wěn)定性? 研究隨著時(shí)間的變化，DPPH自由基的醇溶液中吸光度值的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1 h內(nèi)，A值保持穩(wěn)定，見圖2，因此所有樣品應(yīng)在1 h之內(nèi)測(cè)定完畢。

2.6 DPPH反應(yīng)體系的吸收光譜及測(cè)定波長的確定? 在DPPH自由基清除法中，有機(jī)溶劑中的DPPH可形成穩(wěn)定的具有兩個(gè)典型的特征吸收峰的自由基，自由基顏色為紫紅色。當(dāng)反應(yīng)體系中存在抗氧化劑時(shí)，抗氧化劑能提供出相應(yīng)個(gè)數(shù)的氫原子和電子給DPPH自由基，使其生成DPPH2，DPPH2可以改變?nèi)芤旱奈舛戎岛吞卣魑辗?，峰值變?nèi)?，吸光度降低。在此反?yīng)中，被測(cè)物質(zhì)的抗氧化能力可以有體系顏色的變化來表示，顏色褪色越多，說明抗氧化能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中用UV-Vis光譜對(duì)DPPH自由基溶液進(jìn)行掃描。結(jié)果顯示，DPPH溶液在517 nm和328 nm處出現(xiàn)特征吸收峰，而淫羊藿總黃酮的吸收峰在260 nm，見圖3。說明淫羊藿總黃酮本身在517 nm處不會(huì)對(duì)DPPH測(cè)定造成光譜干擾，因此實(shí)驗(yàn)以517 nm作為DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長。

2.7 DPPH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)? 新鮮配制的DPPH溶液在波長為328 nm和517 nm處有很強(qiáng)的特征吸收峰，見圖4。DPPH溶液在≤1 h時(shí)，穩(wěn)定性好，但若長時(shí)間放置在室溫下，并且在光照氧化條件下，放置時(shí)間越長，DPPH溶液顏色會(huì)由紫紅色變淺，吸光度值在波長為517 nm處降低明顯。結(jié)果表明，DPPH溶液的光吸收值會(huì)受到光照強(qiáng)度和溫度高低的影響。因此，為了得到準(zhǔn)確的測(cè)試結(jié)果，DPPH溶液保存環(huán)境必須是低溫，反應(yīng)也應(yīng)在避光低溫條件下完成。

2.8 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)? 避光精密稱定一定量的DPPH，用乙醇作溶劑，配制成5.0 mmol/L的儲(chǔ)備液，-20 ℃存放，現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確移取4.5 ml DPPH標(biāo)準(zhǔn)液于10 ml比色管中，分別加入不同體積相同濃度的樣品，構(gòu)成濃度梯度，其中一支管中不加樣品溶液（空白），用無水乙醇做溶劑，稀釋定容至刻度線5.0 ml處，搖勻，避光靜置，室溫下反應(yīng)0.5 h，測(cè)定溶液的A517 nm值。計(jì)算其清除率，清除率按下式計(jì)算：

清除率（%）=×100%

式中A0為空白管的吸光度;A樣為樣品管的吸光度。

淫羊藿總黃酮提取液對(duì)DPPH·的清除作用見圖5。在一定的濃度范圍內(nèi)，DPPH·的清除率隨淫羊藿總黃酮濃度的增加而增大，當(dāng)淫羊藿總黃酮濃度的增加到一定濃度時(shí)，清除率穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。當(dāng)清除率達(dá)50%時(shí)，淫羊藿總黃酮的質(zhì)量濃度為：IC50=0.00092 mg/ml。淫羊藿總黃酮的質(zhì)量濃度≥0.002 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)最大，最大清除率為79.17%。這說明淫羊藿總黃酮對(duì)DPPH·有較強(qiáng)的清除作用。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，自由基氧化損傷[8]是能夠誘發(fā)多種疾病，因此，清除自由基的研究已經(jīng)成為了當(dāng)今藥學(xué)學(xué)科領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，研究也已發(fā)現(xiàn)，淫羊藿[9]總黃酮具有良好的抗氧化性能，該類化合物可以與自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞處于還原狀態(tài)，抵抗機(jī)體損傷，減少疾病的產(chǎn)生，本論文通過正交實(shí)驗(yàn)，得出了在溫度70 ℃、60%乙醇濃度和1∶25料液比的最優(yōu)提取工藝條件下，淫羊藿精提液中總黃酮質(zhì)量濃度為10.15 μg/ml，含量達(dá)31.72%。通過光譜滴定法結(jié)果表明，淫羊藿總黃酮的質(zhì)量濃度≥0.002 mg/ml時(shí)，清除率達(dá)79.17%。表明淫羊藿總黃酮對(duì)DPPH自由基有很好的清除能力，抗氧化活性強(qiáng)。

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收稿日期：2020-06-11;修回日期：2020-06-26

編輯/成森