分散固相萃取–超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定玉米油中4 種黃曲霉毒素

李莉，李碩

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

黃曲霉毒素(AFT)是一類由黃曲霉或寄生曲霉等在高溫潮濕環(huán)境中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)相似的高毒性次生代謝產(chǎn)物［1］。黃曲霉毒素作為世界上發(fā)現(xiàn)較早、危害最嚴(yán)重的強(qiáng)致癌性真菌毒素，一直受到國(guó)際社會(huì)的高度重視［2］。目前已知的黃曲霉毒素有20 多種，常見(jiàn)的有AFB1，AFB2，AFG1和AFG2，其中AFB1毒性最強(qiáng)，具有極強(qiáng)的致癌性、致畸性和致突變性，早在1993 年就被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為1類致癌物［3］。黃曲霉毒素的產(chǎn)毒菌株廣泛存在于玉米、花生、大豆等農(nóng)作物中，隨著生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)污染相關(guān)的食品或糧油產(chǎn)品［1，4］。為了保障人類飲食安全，各國(guó)陸續(xù)制定了食品中黃曲霉毒素的最高限量標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)GB 2761–2017 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》［5］規(guī)定植物油中AFB1的限量為10 μg／kg(花生油、玉米油為20 μg／kg )。因此測(cè)定玉米油中黃曲霉毒素具有重要意義。

目前食品中黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有液相色譜法［6–7］、酶聯(lián)免疫吸附法［8–9］、液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜法［3，10–13］等，根據(jù)近年來(lái)標(biāo)準(zhǔn)修訂情況和國(guó)際主流檢測(cè)方法發(fā)展趨勢(shì)，目前液相色譜–質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其高準(zhǔn)確性、高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，成為黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的主要方向［2］。植物油成分以脂肪酸為主，富含蛋白質(zhì)、維生素等物質(zhì)，并含有少量色素，成分復(fù)雜，植物油前處理的關(guān)鍵是去除油脂及其它極性雜質(zhì)。目前常用的前處理方法主要有免疫親和柱法［13–15］、液液萃取法［11–16］、固相萃取法［17–18］及基于QuEChERS 原則的快速前處理技術(shù)［19–22］。免疫親和柱凈化法步驟復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且價(jià)格昂貴，無(wú)法滿足大批量樣品快速檢測(cè)的需要；液液萃取法存在有機(jī)溶劑消耗量較大，容易造成目標(biāo)物流失，不利于環(huán)境保護(hù)等不足［23］；分散固相萃取法以及基于同樣的原理發(fā)展起來(lái)的其它快速前處理技術(shù)，以其快速、簡(jiǎn)單、便宜、有效、可靠、安全的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用［24–25］。目前玉米油中黃曲霉毒素快速前處理技術(shù)主要選擇PSA(N-丙基乙二胺)，C18等填料單獨(dú)或進(jìn)行組合作為凈化試劑［3–4］，而采用分散固相萃取凈化(DisQuE 凈化)技術(shù)同時(shí)測(cè)定玉米油中4 種黃曲霉毒素的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者以分散固相萃取凈化技術(shù)處理玉米油樣品，經(jīng)乙腈提取，鹽析分層，DisQuE 凈化，采用超高效液相色譜–三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玉米油中黃曲霉毒素。該方法簡(jiǎn)便快速，可操作性強(qiáng)，避免了免疫親和柱和傳統(tǒng)固相萃取柱繁瑣的凈化步驟，降低了檢測(cè)成本，提高了檢測(cè)效率，滿足玉米油中多種黃曲霉毒素快速測(cè)定的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜–三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：LCMS–8060 型，日本島津公司；

分析天平：AL 204 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒–托利多公司；

超聲波清洗器：KQ–3200DE 型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司；

渦旋混勻器：Vortex Genie 2 型，美國(guó)Scientific Industries 公司；

恒溫培養(yǎng)振蕩器：KWY–240 型，上海智誠(chéng)分析儀器有限公司；

超純水純化系統(tǒng)：Advance RO+Pro VF 型，德國(guó)Sartorius 公司。

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：均為50 μg／mL，編號(hào)為STD#1086，青島普瑞邦公司；

乙腈：色譜純，德國(guó)默克公司；

甲酸：質(zhì)譜級(jí)，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；

DisQuE 凈化管：2 mL，含有750 mg 硫酸鎂、250 mg PSA、150 mg C18和150 mg Al-N，美國(guó)沃特世公司；

MPFC–QuEChERS 超濾凈化柱：適用于復(fù)雜基質(zhì)，北京綠綿科技有限公司；

QuEChERS 提取鹽包：含有4 g MgSO4和1 g NaCl，北京綠綿科技有限公司；

玉米油：市售；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Infinity Poroshell 120 SB–C18柱(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液，B 為0.1%甲酸–乙腈溶液；洗脫方式：梯度洗脫，流量為0.3 mL／min； 洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣體積：5 μL，柱溫：40℃。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描模式：正離子模式；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式；霧化氣流量：3 L／min；干燥氣流量：10 L／min；加熱氣流量：10 L／min；接口溫度：300℃；接口電壓：4.0 kV；其它質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 黃曲霉毒素的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 樣品預(yù)處理

1.3.1 提取

精密稱取5 g(精確至0.001 g)玉米油樣品于50 mL 具塞離心管中(對(duì)于加標(biāo)樣品，加入所需體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液)，加入10 mL 提取溶液(乙腈與水的體積比為84∶16)，旋渦混勻30 s，在搖床中于室溫下振蕩提取30 min，然后加入4 g 無(wú)水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振搖1 min(振搖過(guò)程中溶液放熱，用冰水冷卻至室溫)，以8 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液待凈化。

1.3.2 凈化

取1.3.1 中的上清液1 mL 于DisQuE 凈化管中，渦旋混合1 min，以5 000 r／min 轉(zhuǎn)速離心3 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 聚四氟乙烯微孔濾膜過(guò)濾，濾液作為待測(cè)樣品溶液。

1.4 溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：1 μg／mL，精確移取黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL 置于10 mL 容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至標(biāo)線，搖勻。

系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：取空白玉米油樣品，按照1.3 方法進(jìn)行樣品預(yù)處理，制得空白樣品提取液。分別在空白提取液中加入適量的上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)量濃度均分別為0.5，1，5，10，20，50 μg／L 的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果及討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用直接進(jìn)樣的方式，將質(zhì)量濃度為50 μg／L 的4 種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀，分別對(duì)目標(biāo)化合物質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2在ESI 源下均有較高的響應(yīng)。對(duì)比母離子在正、負(fù)離子模式的響應(yīng)，4 種黃曲霉毒素在正離子模式下均具有更高的響應(yīng)，所以選擇ESI+掃描模式。對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到目標(biāo)化合物的［M+H］+母離子。隨后優(yōu)化電壓，選擇響應(yīng)最強(qiáng)的2 個(gè)子離子，并在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下優(yōu)化出子離子響應(yīng)最優(yōu)時(shí)的碰撞能量，優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式色譜圖如圖1 所示。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取條件

圖1 黃曲霉毒素MRM 色譜圖

玉米油基質(zhì)較為復(fù)雜，提取溶劑的選擇直接影響目標(biāo)化合物的提取效率，選擇合適的提取溶劑可以提高提取效率并降低基質(zhì)的干擾。食品中黃曲霉毒素常用的提取溶劑有乙腈、甲醇、丙酮等，其中乙腈為極性較強(qiáng)的低毒溶劑，對(duì)黃曲霉毒素有較高的提取率。同時(shí)乙腈對(duì)蛋白、脂肪有一定的去除作用，對(duì)于玉米油樣品具有更好的選擇性，提取效率更高，因此實(shí)驗(yàn)選擇乙腈作為提取溶劑。國(guó)標(biāo)方法［26］中，植物油中黃曲霉毒素的提取溶劑為乙腈–水溶液(體積比為84∶16)。試驗(yàn)考察了提取溶劑中含水量對(duì)提取效率的影響，結(jié)果表明，用純乙腈或國(guó)標(biāo)方法提取，4 種黃曲霉毒素的回收率均滿足要求。提取溶劑中加入適量水有利于提高樣品的滲透性和去除極性雜質(zhì)，因此選用國(guó)標(biāo)方法的提取溶液，即乙腈–水溶液(體積比為84∶16)。

樣品經(jīng)過(guò)提取后，提取液中仍然存在大量的共萃物［24］，在提取液中加入適量無(wú)機(jī)鹽，可以協(xié)同飽和水溶液，降低乙腈層中水含量，加速提取液分層，從而降低目標(biāo)物質(zhì)在水中的溶解度，有利于目標(biāo)物質(zhì)向乙腈中轉(zhuǎn)移［25］，同時(shí)還能減少干擾雜質(zhì)的引入，有利于樣品溶液的進(jìn)一步凈化。其中MgSO4和NaCl 的鹽析效果最好［24］，采用4 g MgSO4和1 g NaCl 的混合鹽可以獲得理想的分層效果。

2.2.2 凈化方式

分別考察分散固相萃取法(DisQuE 凈化管凈化)和直接通過(guò)式超濾法(MPFC–QuEChERS 復(fù)雜凈化柱凈化)2 種凈化方式對(duì)4 種黃曲霉毒素的提取回收率的影響。以不含黃曲霉毒素的玉米油為基質(zhì)，添加20 μg／kg 的黃曲霉毒素，按照1.3.1 方法提取后，經(jīng)兩種方式凈化，上機(jī)測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可以看出，采用DisQuE 凈化管凈化的回收率高于MPFC–QuEChERS 超濾型凈化柱凈化的回收率。DisQuE凈化管含有硫酸鎂、PSA、C18和中性氧化鋁Al-N，硫酸鎂可以進(jìn)一步除去提取液中的水分，PSA 吸附共萃取物中的極性有機(jī)酸、極性色素等雜質(zhì)，C18能吸附部分脂肪等非極性化合物，Al-N 能夠吸附除去樣品中的色素等極性化合物，而黃曲霉毒素不被吸附，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)與雜質(zhì)分離，達(dá)到較好的凈化效果。因此選擇DisQuE 凈化管凈化。

圖2 不同凈化方式下4 種黃曲霉毒素的回收率

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

通過(guò)對(duì)比空白基質(zhì)加標(biāo)溶液與純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值，考察樣品基質(zhì)對(duì)黃曲霉毒素測(cè)定結(jié)果的影響?；|(zhì)效應(yīng)＝空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值／純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)響應(yīng)值×100%，基質(zhì)效應(yīng)大于100%時(shí)，表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；基質(zhì)效應(yīng)小于100%時(shí)，為基質(zhì)抑制效應(yīng)［27］。試驗(yàn)結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，凈化后的玉米油中4 種毒素基質(zhì)效應(yīng)約為129%～167%，存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。為了獲得更準(zhǔn)確的定量效果，采取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線校正法進(jìn)行定量分析。

2.4 線性方程與檢出限

取1.4 中的系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各5 μL，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定，以目標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。分別以3倍信噪比和10 倍信噪比所對(duì)應(yīng)的被測(cè)物的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限。4 種黃曲霉毒素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表3。由表3 可知，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)量濃度在0.5～50 μg／L 范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 9，檢出限和定量限均滿足日常檢測(cè)需要。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)

分別在不含黃曲霉毒素的玉米油基質(zhì)中，添加5，10，20 μg／kg 的4 種黃曲霉毒素進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，計(jì)算平均回收率及測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的平均回收率為81.3%～113.5%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～9.6%，表明該方法準(zhǔn)確度和精密度良好，滿足日常檢測(cè)要求。

表4 加標(biāo)回收與精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.6 樣品測(cè)定

按所建方法對(duì)市售的36 批玉米油樣品進(jìn)行測(cè)定，36 批玉米油中均未檢出4 種黃曲霉毒素。

3 結(jié)語(yǔ)

采用分散固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行提取凈化，并結(jié)合超高效液相色譜–串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了玉米油中4 種黃曲霉毒素的快速測(cè)定方法。該方法操作簡(jiǎn)便，前處理時(shí)間短，檢測(cè)效率高，可以實(shí)現(xiàn)批量樣品的快速檢測(cè)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，有效克服了使用質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)基質(zhì)效應(yīng)所帶來(lái)的誤差，提高了方法的準(zhǔn)確性，適用于玉米油中黃曲霉毒素類的定性確證與定量檢測(cè)。