黃芪丹參配伍提取物對(duì)心肌缺血大鼠的心臟保護(hù)作用

張瓅方， 李夢(mèng)華

(1.南陽理工學(xué)院河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南陽 473004； 2.南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校， 南陽 473061)

心血管疾病尤其是缺血性心臟病，是全球范圍內(nèi)占據(jù)疾病死亡率的主要原因[1]。雖然多數(shù)患有心肌梗死(myocardial infarction，MI)的病人依靠化學(xué)藥物和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coro-nary intervention，PCI)后癥狀得到改善，但仍有一部分患者因微血管病變、術(shù)后再狹窄和彌漫性病變等并發(fā)癥而無法接受有效治療。因此，探索新的治療策略來緩解MI缺血和維持心臟功能顯得尤為重要[2]?；謴?fù)缺血心肌的血供是治療MI的關(guān)鍵。隨著血管新生概念的發(fā)展，越來越多的研究證明治療性血管生成能有效改善MI血供[3]。血管生成是一個(gè)復(fù)雜的過程，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等促血管生成因子能顯著促進(jìn)缺血區(qū)側(cè)支血管的增殖，減少梗死面積[4-5]。然而，臨床中關(guān)于基因治療的效益仍然存在爭(zhēng)議，例如有限的有效期、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和其他安全問題等[6-7]。除了生長(zhǎng)因子外，干細(xì)胞也有助于新血管形成。已經(jīng)證明，干細(xì)胞分泌可溶性旁分泌因子，并能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞[8-9]。

MI發(fā)病時(shí)典型臨床表現(xiàn)為心前區(qū)不同程度疼痛，這與中醫(yī)“胸痹”“真心疼”等病癥中胸部悶痛，嚴(yán)重時(shí)胸痛徹背、背痛徹心的主要癥狀極其相似。中醫(yī)治療此類疾病采用“益氣化瘀生新”理論和西醫(yī)“治療性促血管新生”概念有著異曲同工之處，課題組前期選用益氣活血類代表藥黃芪和丹參配伍提取物進(jìn)行心肌梗死干預(yù)治療，證實(shí)了黃芪、丹參配伍提取物的濃度劑量和治療MI作用呈量效正相關(guān)關(guān)系[10]，在VEGF/KDR信號(hào)通路介導(dǎo)下，可上調(diào)血管成熟肽類生長(zhǎng)因子(angiopoietin I，AngI)和血管內(nèi)皮特異性組織蛋白(endothelial nitricoxide sythase，eNOS),證實(shí)黃芪、丹參配伍提取物調(diào)控參與促血管生成因子作用明顯[11]。中藥配伍是中醫(yī)藥在臨床應(yīng)用相容性的基本表現(xiàn)形式，黃芪和丹參組合是中醫(yī)治療心血管疾病的常用藥對(duì)?，F(xiàn)以MI大鼠模型為研究對(duì)象，探討黃芪丹參配伍提取物對(duì)缺血性心肌的保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 黃芪和丹參的制備

黃芪和丹參提取物在國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“黃芪丹參配伍提取物對(duì)心肌梗死后心室重構(gòu)中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號(hào)傳導(dǎo)通路影響的研究(81173372)”基礎(chǔ)上，由南陽理工學(xué)院方藥研究所鑒定并提供蒙古黃芪干燥根經(jīng)和唇形科植物丹參干燥根經(jīng)，經(jīng)水提和大孔吸附樹脂純化法提取黃芪總苷含量66.9%，每克含原生藥32.21 g；丹參總酚酸含量63.7%，每克含原生藥15.46 g。

1.2 建立MI大鼠模型

實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SD大鼠 8 周齡雄性，體重(220±20) g[動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(豫)2015—0005；動(dòng)物質(zhì)量合格證：1001297]。實(shí)驗(yàn)前，將大鼠置于SPF環(huán)境條件下，在(26±1) ℃和55%±10%濕度條件下進(jìn)行12 h明暗交替飼養(yǎng)1周。所有動(dòng)物程序和方案均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行，并經(jīng)南陽理工學(xué)院動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)的倫理準(zhǔn)則批準(zhǔn)進(jìn)行(批準(zhǔn)號(hào)：NYISTEEC—2017026)。參照經(jīng)典MI造模方法，以4%水合氯醛注射液麻醉大鼠后，通過結(jié)扎左前降支建立心肌梗死模型[12]。

1.3 分組及藥物管理

實(shí)驗(yàn)分批進(jìn)行，每組8只。第一批大鼠分為 6組，為假手術(shù)組(Sham，等量生理鹽水)、模型組(Model，等量生理鹽水)、培哚普利組[PB,3 mg/(kg·d)]國(guó)藥準(zhǔn)字H20034053，施維雅(天津)制藥有限公司)、黃芪提取物組[HQ，50 mg/(kg·d)]、丹參提取物組[50 mg/(kg·d)]和黃芪丹參配伍提取物組[HQ+DS，50 mg/kg·d)]，以確定對(duì)心功能和MI區(qū)域百分比有最佳影響的中藥組。采用Notch抑制劑RO4929097(s1575,Selleckchem，UK)探討Notch1和NICD通路在中藥干預(yù)的缺血心肌血管生成中的作用。將第二批大鼠分為假手術(shù)組、模型組、HQ+DS組和HQ+DS+RO4929097[HQ+DS-I，10 mg/(kg·d)]組，觀察中藥對(duì)CD31和vWF的左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fractions,LVEF)和平均光密度(average optical densities,AODs)的影響。RO4929097以1%羧甲基纖維素和0.2%Tween80(C8621、T8360，北京索萊寶科技有限公司)配制為混懸液。從模型建立后第 2 d 開始，每天灌胃一次，自由活動(dòng)和進(jìn)食持續(xù) 21 d。第22天處死大鼠后將血清分離進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。在冰臺(tái)上快速取出心臟分為兩部，一部分4%多聚甲醛中室溫固定12 h后進(jìn)行組織病理觀察，另一部分保存于-80 ℃冰箱進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.4 超聲評(píng)價(jià)左室射血分?jǐn)?shù)

用小動(dòng)物超聲成像儀(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)檢測(cè)大鼠心臟。4%水合氯醛麻醉后將 MS-250 探針放在大鼠左胸上并指向右側(cè)，以獲得左心室的長(zhǎng)軸視圖。每只大鼠測(cè)量3個(gè)連續(xù)心臟周期取平均值，并計(jì)算各組LVEF。

1.5 Masson染色法測(cè)定心肌梗死面積百分比

固定在4%多聚甲醛的大鼠心臟取出后在不同濃度的酒精中脫水。將脫水樣品嵌入石蠟包埋切片，并用Masson操作說明(G1006，武漢谷歌生物科技有限公司)進(jìn)行連續(xù)染色。染色后的心肌樣本用數(shù)字切片掃描儀(Panoramic MIDI，3DHISTECH，Hungary)進(jìn)行掃描。梗死心肌的像素以藍(lán)色為特征，正常心肌的像素以紅色為特征，采用ImageJ(Wayne Rasband，National Institutes of health，USA)計(jì)算。MI面積百分比計(jì)算為藍(lán)色像素/(藍(lán)色+紅色像素)×100%。

1.6 免疫熒光法檢測(cè)CD31和vWF

將上述切片后獲得的組織切片依次與CD31(GB12063，武漢谷歌生物科技有限公司)、vWF(GB11020，武漢谷歌生物科技有限公司)和DAPI(G1012，武漢谷歌生物科技有限公司)抗體培養(yǎng)。通過顯微鏡(DMIL-RF1，Leica,Germany)獲得梗死邊界區(qū)(IBZ)和心肌梗死區(qū)(MI)的照片(200×)。利用ImageJ計(jì)算CD31和 vWF積分密度和面積。CD31和vWF的平均光密度(AODs)計(jì)算為綜合密度/面積×100%。

1.7 測(cè)量VEGF和bFGF

ELISA法檢測(cè)VEGF(KE10009，Proteintech，USA)和bFGF(ab100670, Abcam, UK)，根據(jù)制造商提供操作步驟進(jìn)行，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Epo-ch2, Biotek, USA)分析光密度。

1.8 Western blot法檢測(cè)HIF-1α、FGFR-1、Notch1/NICD、SDF-1、CXCR-4、CT-1

將RIPA蛋白提取試劑與蛋白酶抑制劑混合。用電動(dòng)均質(zhì)機(jī)將組織勻漿后冰上孵育20 min，14 000g離心5 min，BCA法測(cè)定樣品的蛋白質(zhì)濃度，用RIPA緩沖液調(diào)節(jié)至最低濃度。在95 ℃下 5 min 裂解蛋白質(zhì)變性，預(yù)處理SDS聚丙烯酰胺凝膠，將樣品加載到凝膠上，進(jìn)行電刺激，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉。與原發(fā)性抗體抗GAPDH(5174，CST，USA)孵育后，HIF-1α(36169，CST，USA)、FGFR-1(9740，CST，USA)、Notch1(3608，CST，USA)、NICD(4147S，CST)、SDF-1(3740，CST，USA)、CXCR-4(60042-1-1 g, Proteintech, USA)和CT-1(YT0638,ImmunoWay,USA)在4 ℃ 下，用二級(jí)抗體(115-035-003, Jackson, USA)室溫下培養(yǎng)2 h。用凝膠成像儀(ChemicDoc XRS+, Bio-Rad, USA)對(duì)膜進(jìn)行成像，ImageJ進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 HQ+DS對(duì)心臟功能的影響

2.1.1 LVEF比較

左前降支結(jié)扎后左心室收縮功能下降，心室壁運(yùn)動(dòng)異常。模型組與假手術(shù)組相比，LVEF明顯降低(P<0.001)。治療后，與模型組相比，PB組和HQ+DS組的LVEF均顯著升高(P<0.05或P<0.01)。模型組與HQ組(P>0.05)和DS組(P>0.05)無顯著性差異[圖1(b)]。

2.1.2 MI面積比

非接觸區(qū)心肌細(xì)胞染色為紅色，Masson染色后梗死區(qū)呈藍(lán)色，梗死組織以膠原纖維和炎性細(xì)胞為特征。與假手術(shù)組相比，模型組和治療組心肌梗死面積/左心室面積的百分比明顯增加。治療后，與模型組相比，PB組、DS組和HQ+DS組心肌梗死面積/左室面積百分比明顯降低(P<0.05或P<0.01)[圖1(a)、圖1(c)]。

2.1.3 血清中VEGF和bFGF水平

模型組血清bFGF水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.01)。治療后，PB組、HQ組、DS組和HQ+DS組中bFGF水平均升高，其中HQ+DS組bFGF水平較模型組明顯升高(P<0.01)[圖1(e)]。各組VEGF水平無顯著性差異(P>0.05)[圖1(d)]。HQ組、DS組和HQ+DS組的LVEF、心肌梗死面積百分比、VEGF和bFGF水平相比較，HQ+DS組對(duì)改善心臟功能的作用明顯優(yōu)于HQ組和DS組。

2.2 HQ+DS對(duì)心臟保護(hù)機(jī)制

2.2.1 抑制Notch信號(hào)后LVEF和MI面積測(cè)定及組織病理學(xué)觀察

Notch受體分裂后釋放NICD，NICD轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核并能啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，當(dāng)分泌酶活性被RO4929097抑制時(shí)，NICD釋放受阻。實(shí)驗(yàn)中，HQ+DS組LVEF與模型組相比有明顯改善，HQ+DS-I組與模型組LVEF無顯著差異[圖2(c)]。與模型組相比，HQ+DS組和HQ+DS-I組心肌梗死面積百分比降低(P<0.01或P<0.05)[圖2(d)]。這一發(fā)現(xiàn)表明Notch1/NICD通路可能在HQ+DS介導(dǎo)的心肌梗死后心臟功能保護(hù)中起重要作用，盡管它可能不是唯一通路。Masson染色顯示假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，僅有少量炎性細(xì)胞出現(xiàn)在HQ+DS組[圖2(a)]。模型組梗死區(qū)心肌斷裂溶解，伴有大量纖維增生紊亂，炎癥反應(yīng)明顯，以大量浸潤(rùn)性炎性細(xì)胞為特征[圖2(b)]。模型組和HQ+DS-I組炎癥反應(yīng)強(qiáng)于HQ+DS組。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.01，***為P<0.001；與模型組相比，$為P<0.05，$$為P<0.01；n=8圖2 Notch1/NICD通路對(duì)MI心肌保護(hù)作用Fig.2 The protective effect of Notch1/NICD pathway on MI myocardium

2.2.2 IBZ中CD31和vWF的AODs值

CD31和vWF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記蛋白，經(jīng)免疫熒光染色后CD31、vWF和DAPI呈現(xiàn)綠色、紅色和藍(lán)色。由于血管管腔小或模糊，很難計(jì)算血管數(shù)目，因此用CD31和vWF的AODs來評(píng)價(jià)血管生成密度。染色顯示新生血管呈綠點(diǎn)，細(xì)胞核呈藍(lán)色，染色均勻分布[圖3(a)、圖3(b)中假手術(shù)組]。在模型組中，因梗死導(dǎo)致缺血心肌細(xì)胞代償性肥大或部分溶解，細(xì)胞核和血管生成變得不規(guī)則或不均勻[圖3(a)、圖3(b)中模型組]。與假手術(shù)組相比，模型組和HQ+DS-I組中CD31的AODs顯著降低(P<0.001)，而HQ+DS組的CD31的AODs顯著增加(P<0.05)[圖3(c)]。IBZ中形成的毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)用于改善缺血心肌的血液供應(yīng)，與模型組相比，HQ+DS組細(xì)胞核密度更高[圖3(a)、圖3(b)中配伍組]。HQ+DS-I組與HQ+DS組相比，CD31的AODs降低。這一結(jié)果表明，Notch通路可能在HQ+DS介導(dǎo)的IBZ血管生成中起到促進(jìn)作用。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.01；與模型組相比，$為P<0.05；與HQ+DS組相比，&為P<0.05；n=8圖3 Notch通路在HQ+DS介導(dǎo)的IBZ血管生成中作用Fig.3 The role of Notch pathway in HQ+DS-mediated IBZ angiogenesis

2.2.3 MI中CD31和vWF的AODs值

MI區(qū)壞死組織不能完全溶解吸收，肉芽組織由新的毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞組成。MI區(qū)的病理過程與IBZ區(qū)不同，模型組CD31和vWF的AODs均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05或P<0.001)。模型組的細(xì)胞核比假手術(shù)組更致密，因?yàn)槿庋啃纬商攸c(diǎn)是血管生成、成纖維細(xì)胞增殖和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)[圖4(a)、圖4(b)中模型組]。HQ+DS組和HQ+DS-I組與模型組相比，CD31和vWF的AODs降低(P<0.001)[圖4(c)]。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，***為P<0.001；與模型組相比，$$$為P<0.001；n=8圖4 MI中CD31和vWF的AODs值Fig.4 AODs values of CD31 and vWF in MI

2.2.4 血清中VEGF和bFGF水平

與假手術(shù)組相比，模型組bFGF水平明顯降低(P<0.001)。與模型組相比，HQ+DS組和HQ+DS-I組的bFGF水平顯著升高(P<0.001)[圖5(b)]。各組VEGF水平無顯著差異(P>0.05)[圖5(a)]。

與假手術(shù)組相比，***為P<0.001；與模型組相比，$$$為P<0.001；n=8圖5 各組血清中VEGF和bFGF水平Fig.5 Serum levels of vascular endothelial growth factor and bFGF in each group

2.2.5 HIF-1α、FGFR-1、SDF-1、CXCR-4和CT-1的表達(dá)

血管生成涉及一系列生物學(xué)過程，干細(xì)胞動(dòng)員也參與血管生成，因此實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)HIF-1α和FGFR-1的表達(dá)，此外還測(cè)定了SDF-1、CXCR-4和CT-1，以研究HQ+DS對(duì)干細(xì)胞動(dòng)員的影響。模型組和HQ+DS組的HIF-1α表達(dá)明顯高于假手術(shù)組(P<0.001或P<0.01)。HQ+DS組HIF-1α表達(dá)下降(P<0.05)，而FGFR-1表達(dá)增加[圖6(a)]。在任何一組中，參與干細(xì)胞動(dòng)員的CXCR-4表達(dá)沒有差異(P>0.05)。與假手術(shù)相比，模型組和HQ+DS組SDF-1和CT-1表達(dá)顯著增加(P<0.001或P<0.01)。HQ+DS組與模型組相比，SDF-1和CT-1表達(dá)顯著增加(P<0.01)[圖6(b)]。

2.2.6 Notch1和NICD的表達(dá)

Notch家族參與血管生成和干細(xì)胞分化。在本次實(shí)驗(yàn)中，RO4929097被用來探討Notch/NICD通路在HQ+DS對(duì)血管生成的影響作用。HQ+DS組與模型組比較，增加了Notch1和NICD的表達(dá)(P<0.05)。經(jīng)過HQ+DS-I干預(yù)后，與HQ+DS組相比，Notch1和NICD表達(dá)降低(P<0.01或P<0.001)[圖6(c)]。

與假手術(shù)組相比，*為P<0.05，**為P<0.001，***為P<0.001；與模型組相比，$為P<0.05，$$為P<0.01；與HQ+DS組相比，&&為P<0.01；n=8圖6 Western blot檢測(cè)血管生成相關(guān)因子和干細(xì)胞動(dòng)員蛋白的表達(dá)Fig.6 Western blot was used to detect the expression of angiogenesis-related factors and stem cell mobilization proteins

3 討論

黃芪和丹參是中醫(yī)益氣活血類的常用藥對(duì)組合，多應(yīng)用于氣虛血瘀證的治療，尤其是在缺血性疾病應(yīng)用中效過顯著，但黃芪丹參配伍使用對(duì)心臟的保護(hù)機(jī)制尚不明確。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪丹參配伍能顯著改善MI大鼠的LVEF，降低心肌梗死面積，效果優(yōu)于使用單味黃芪或丹參。黃芪丹參配伍增加了IBZ中CD31的AODs，證明黃芪丹參配伍對(duì)心臟的保護(hù)作用可能與促進(jìn)血管生成有關(guān)。因缺血而誘導(dǎo)血管生成的關(guān)鍵問題是新生毛細(xì)血管能否有效增加血液供應(yīng)，活血化瘀類中藥在特定組織中是否具有優(yōu)先作用，是值得進(jìn)一步研究的課題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組形成更多肉芽組織，并以新生血管為特征，提示梗塞區(qū)新生血管可能只促進(jìn)肉芽組織成熟，加速梗塞心肌纖維化，導(dǎo)致缺血組織供血減少。血管生成主要由組織缺氧通過HIF-1α激活來刺激[13]。HIF-1α激活許多基因的轉(zhuǎn)錄，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因VEGF、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體flt-1和bFGF[14-15]。bFGF是一種有效的血管生成因子，可刺激參與血管生成和肉芽組織形成的成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。HQ+DS組和模型組的HIF-1α和FGFR-1表達(dá)均明顯高于假手術(shù)組，HQ+DS組的HIF-1α表達(dá)較模型組下降，HIF-1α的表達(dá)受氧濃度的嚴(yán)格影響。低氧條件下，HIF-1α的泛素化和降解受到抑制，由此產(chǎn)生的HIF-1α在細(xì)胞質(zhì)中的積累刺激多種血管生成因子，包括bFGF[16]。HQ+DS組的HIF-1α表達(dá)下降，提示HQ+DS對(duì)治療后缺血心肌氧濃度升高。干細(xì)胞療法為缺血性新血管形成提供了很好的治療潛力，已經(jīng)證明，SDF-1與CXCR-4結(jié)合在一起，有助于動(dòng)員干細(xì)胞并將其招募到缺血組織中[17-18]。SDF-1不僅有助于植入骨間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的歸巢，而且還可以增加缺血時(shí)的血管密度并誘導(dǎo)血管生成[19]。CT-1是一種強(qiáng)有力的細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞植入，通過促進(jìn)骨間充質(zhì)干細(xì)胞的持續(xù)性和黏附性來維持梗塞心臟的功能[20]。研究還表明，CT-1可促進(jìn)干細(xì)胞的心臟分化[21-22]。研究結(jié)果表明，HQ+DS顯著增強(qiáng)了SDF-1和CT-1的表達(dá)，提示干細(xì)胞可能被動(dòng)員到缺血心肌中，以保護(hù)受損組織。然而，HQ+DS調(diào)控干細(xì)胞促進(jìn)缺血性心肌細(xì)胞的血管生成的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

Notch信號(hào)控制血管網(wǎng)的血管生長(zhǎng)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和動(dòng)靜脈的分化[23]。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有4個(gè)受體(Notch1-4)和5個(gè)配體(DII1、DII3、DII4、Jaggedl、Jagged2)。一旦Notch配體與其受體結(jié)合，Notch信號(hào)就發(fā)生，Notch受體從細(xì)胞膜釋放NICD。NICD轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，從而影響細(xì)胞的增殖和分化[24]。Notch1/NICD參與缺血組織的血管生成，有利于干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[25-27]。在本研究中，HQ+DS上調(diào)了Notch和NICD的表達(dá)，并在Notch分泌酶被抑制后不再增加NICD的水平，提示Notch1/NICD信號(hào)可能在HQ+DS介導(dǎo)的缺血心肌血管生成中起到重要作用。然而，缺氧是否影響Notch激活仍不清楚。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，HQ+DS對(duì)MI大鼠的心臟保護(hù)作用可能取決于其在缺血區(qū)的促血管生成作用。此外，Notch信號(hào)和干細(xì)胞動(dòng)員都可能參與HQ+DS促進(jìn)的血管生成。研究結(jié)果有助于加深對(duì)活血化瘀類中藥的認(rèn)識(shí)，為HQ+DS作為心肌缺血相關(guān)疾病的治療或聯(lián)合治療提供更多的治療依據(jù)。