FSHR基因多態(tài)性與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)性分析

余麗金 許艷 崔紅旺 溫廣宇

1.海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院，海南 海口 570203 2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570102

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是一種多基因調(diào)控的遺傳性疾病，主要表現(xiàn)為骨脆性增加、骨組織微結(jié)構(gòu)損壞、全身骨量降低[1]。骨質(zhì)疏松病因與老齡化、環(huán)境、激素水平及遺傳等多種因素有關(guān)，其中婦女進(jìn)入更年期后，雌激素缺乏會(huì)使骨生長(zhǎng)落后于骨吸收速度，進(jìn)而造成骨密度(bone mineral density，BMD)大量流失，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[2]。骨質(zhì)疏松發(fā)病率呈逐年增高趨勢(shì)，且極易造成骨折，對(duì)中老年人身心健康造成嚴(yán)重威脅[3]。卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)是垂體前葉嗜酸性粒細(xì)胞分泌的一種激素，能促進(jìn)卵泡成熟，與絕經(jīng)前后女性骨代謝調(diào)節(jié)有密切聯(lián)系[4]。FSH受體(FSH receptor，F(xiàn)SHR)是FSH在體內(nèi)發(fā)揮作用的主要途徑，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性會(huì)使得FSH空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響FSHR與其配體相互作用，進(jìn)一步引起受體信息傳遞發(fā)生改變，最終影響FSH發(fā)揮作用[5]。目前關(guān)于FSHR基因多態(tài)性與骨質(zhì)疏松相關(guān)性的研究較少，因此，本研究通過對(duì)FSHR基因外顯子10上680位的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)進(jìn)行探究，進(jìn)而探討FSHR基因多態(tài)性與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的關(guān)聯(lián)性，以期為臨床合理防治絕經(jīng)后女性發(fā)生骨質(zhì)疏松癥提供一定理論依據(jù)，降低骨折發(fā)生幾率。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年8月至2019年3月因骨質(zhì)疏松于本院骨科住院的136例絕經(jīng)后女性患者為研究對(duì)象(骨質(zhì)疏松組)，平均年齡(62.87±6.12)歲；同期選取118例絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松女性作為對(duì)照(對(duì)照組)，平均年齡(64.23±9.24)歲。

收集患者入院時(shí)一般資料，包括年齡、絕經(jīng)期年齡、絕經(jīng)期年限、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、糖尿病、高血壓等。骨質(zhì)疏松患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合中國(guó)人骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)專家共識(shí)中對(duì)骨質(zhì)疏松癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，診斷一般以骨密度下降、骨量減少及發(fā)生脆性骨折等為依據(jù)，發(fā)生脆性骨折即可診斷為骨質(zhì)疏松，其中骨密度等于或低于同性別年輕健康成人骨密度峰值2.5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(T-score≤-2.5 SD)；②絕經(jīng)年齡≥40歲者；③無心腦血管等并發(fā)性疾??；④臨床病理資料完整、清晰者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性骨質(zhì)疏松者；②長(zhǎng)期服用抗癲癇藥物、雌激素、維生素D、肝素等影響骨代謝藥物者；③伴有影響骨代謝疾病者，如骨腫瘤及營(yíng)養(yǎng)不良；④伴有其他低骨量疾病者。本研究中所有患者均由兩名及以上主治醫(yī)師明確診斷。本研究經(jīng)本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，所有受試對(duì)象及家人均由專業(yè)人員詳細(xì)告知研究?jī)?nèi)容后自愿參加，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

血液基因組DNA提取試劑盒(型號(hào)：DK604)，購(gòu)自上海萊楓生物科技有限公司；PCR buffer Set(PCR buffer及MgCl2稀釋液)(型號(hào)：11160010-1)，購(gòu)自蘇州瑞諾德生物科技有限公司；血清骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)ELISA試劑盒(型號(hào)：YM-QP11447)，購(gòu)自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶-5b(tartrate resistant acid phosphatase-5b，TRACP-5b)ELISA試劑盒(型號(hào)：SBJ-H1342)，購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。UVP8000型凝膠成像分析系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；HLC-723G8型全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀，購(gòu)自上海東曹生物科技有限公司；FAITH-1600型全自動(dòng)生化分析儀，購(gòu)自杭州中翰盛泰醫(yī)療器械有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1樣品采集及保存：抽取兩組女性清晨空腹外周靜脈血樣兩份，其中一份置于含5% EDTA抗凝管中，用于提取外周血DNA；另一份置于促凝管中，經(jīng)3 000 r/min離心15 min后收集血清，置于-80 ℃保存。

1.3.2骨代謝、糖代謝及BMD相關(guān)指標(biāo)測(cè)定：TRACP-5b、BALP采用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法測(cè)定；糖化血紅蛋白(HbA1c)采用全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀測(cè)定；空腹胰島素(FINS)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定；BMD測(cè)定時(shí)所有研究對(duì)象均采取仰臥位，測(cè)定腰椎(L2～4)及左側(cè)股骨頸兩個(gè)部位，且均由同一技術(shù)人員操作。

1.3.3FSHR基因多態(tài)性檢測(cè)：參照DNA提取試劑盒說明書提取兩組女性外周血中DNA，核酸定量?jī)x測(cè)定A260和A280，計(jì)算DNA純度和濃度，并將濃度稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存。PCR引物序列，上游：5‘GCAAGTGTGGCTGCTATGAA3’，下游：5‘GTGACATACCCTTCAAAGGC3’。反應(yīng)體系共25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dNTP 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后采用凝膠成像儀分析，將單一明亮條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司純化并測(cè)序，BLAST進(jìn)行測(cè)序結(jié)果比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、絕經(jīng)期年齡、絕經(jīng)期年限、糖尿病患病比例、高血壓患病比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；骨質(zhì)疏松組BMI顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between the two groups

2.2 兩組骨代謝、糖代謝及BMD相關(guān)指標(biāo)比較

兩組HbA1c、FINS比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；骨質(zhì)疏松組TRACP-5b、BALP水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，腰椎BMD、股骨頸BMD水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組骨代謝、糖代謝及BMD相關(guān)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of bone metabolism, glucose metabolism, and BMD related indexes between the two groups

2.3 兩組FSHR基因的SNP構(gòu)成比較

結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因外顯子10的680多態(tài)位點(diǎn)上有Asn680Asn(A/A)型(520 bp)、Asn680Ser(A/S)型(520 bp、413 bp、107 bp)、Ser680Ser(S/S)型(413 bp、107 bp)3種基因型(見圖1)，其中對(duì)照組基因型中A/A型(占62.71%)最多，其次為A/S型(占20.33%)，S/S型(占16.96%)最少；骨質(zhì)疏松組基因型中以S/S型(占59.56%)為主，其次為A/A型(占28.68%)，A/S型(占11.76%)最少。兩組基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組FSHR基因的SNP構(gòu)成比較[n(%)]Table 3 Comparison of SNP composition of FSHR genes between the two groups [n(%)]

圖1 680多態(tài)位點(diǎn)基因型檢測(cè)Fig.1 Genotype detection of 680 polymorphism注：M：DNA laddar；1：A/A型；2：A/S型；3：S/S型

2.4 影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的多因素分析

將骨質(zhì)疏松是否發(fā)生作為因變量，以FSHR的3種基因型(A/A型、A/S型、S/S型)、BMI、TRACP-5b、BALP、腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示S/S型基因型、BMI是影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD是影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的多因素分析Table 4 Multiple analysis of factors influencing osteoporosis incidence

3 討論

骨質(zhì)疏松是一種骨質(zhì)流失導(dǎo)致骨骼脆性增加的代謝性骨骼疾病，正常骨代謝周期中，成骨細(xì)胞不斷形成新骨和破骨細(xì)胞，且不斷吸收舊骨，構(gòu)成動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)平衡打破時(shí)，骨形成速率低于破骨細(xì)胞的骨吸收速率，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，患者有較高的骨折風(fēng)險(xiǎn)，且多發(fā)于絕經(jīng)后女性群體中[7]。目前臨床骨質(zhì)疏松的診斷主要依靠BMD檢查和臨床癥狀，但BMD出現(xiàn)改變需6個(gè)月甚至1年以上時(shí)間，因此不能通過測(cè)定BMD值反映早期骨質(zhì)疏松改變[8]。因此尋找一些與骨質(zhì)疏松關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的檢測(cè)指標(biāo)，可能比BMD檢測(cè)更能快速地評(píng)估骨質(zhì)疏松，且對(duì)防治女性絕經(jīng)后發(fā)生骨質(zhì)疏松有重要意義。

FSH是垂體前葉嗜酸性細(xì)胞合成并分泌的一種促性腺激素，F(xiàn)SH是維持卵泡發(fā)育、成熟的必需物質(zhì)，同時(shí)也是最終引發(fā)排卵的重要物質(zhì)[9]。而FSH只有通過卵泡顆粒的相應(yīng)受體即FSHR介導(dǎo)才能進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其作用，F(xiàn)SHR由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及C-末端區(qū)構(gòu)成，是G蛋白耦合受體超家族成員之一[10]。研究表明[11]，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與生殖有密切聯(lián)系，然而在絕經(jīng)后女性體內(nèi)的研究較少，且并無出現(xiàn)與骨質(zhì)疏松相關(guān)的研究。但目前有許多探究相關(guān)基因多態(tài)性與絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥關(guān)系的研究。馬秋華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因G395 A基因型GG在骨量正常組老人中分布頻率顯著高于骨質(zhì)疏松組老人，可能與骨質(zhì)疏松癥有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHR基因外顯子10的680多態(tài)位點(diǎn)上有Asn680Asn(A/A)型、Asn680Ser(A/S)型、Ser680Ser(S/S)型3種基因型，其中對(duì)照組基因型中A/A型(占62.71%)最多，S/S型(占16.96%)最少；骨質(zhì)疏松組基因型中以S/S(占59.56%)為主， A/S型(占11.76%)最少，兩組基因型比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示S/S純合子基因型與骨質(zhì)疏松可能有關(guān)，F(xiàn)SHR基因型的檢測(cè)可能作為預(yù)測(cè)絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥的一項(xiàng)補(bǔ)充指標(biāo)。

骨代謝指標(biāo)TRACP-5b來源于破骨細(xì)胞，是一種反映骨吸收狀況的指標(biāo)[13]。BALP由成骨細(xì)胞生成，能夠進(jìn)入血循環(huán)并參與骨形成[14]。腰椎BMD、股骨頸BMD是反映骨質(zhì)疏松癥的有效指標(biāo)，骨質(zhì)疏松患者的骨折風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨BMD降低而升高[15]。本研究結(jié)果顯示，骨質(zhì)疏松組TRACP-5b、BALP水平顯著高于對(duì)照組，腰椎BMD、股骨頸BMD水平顯著低于對(duì)照組。提示TRACP-5b、BALP、腰椎BMD、股骨頸BMD等指標(biāo)與骨質(zhì)疏松病情發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可以作為預(yù)測(cè)骨量減少、骨質(zhì)疏松的參考指標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩組年齡、絕經(jīng)期年齡、絕經(jīng)期年限、糖尿病患病比例、高血壓患病比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；骨質(zhì)疏松組BMI顯著低于對(duì)照組。提示較高BMI值可能對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用，減少骨質(zhì)疏松發(fā)生。Logistic回歸分析，結(jié)果顯示S/S型基因型、BMI是影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腰椎L2～4 BMD、股骨頸BMD是影響骨質(zhì)疏松發(fā)生的保護(hù)因素。提示臨床上可通過檢測(cè)FSHR基因型，初步預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。進(jìn)一步提示老人需進(jìn)行健康的生活方式、合理膳食、控制BMI值，減慢骨量的丟失速度，延緩并減少骨質(zhì)疏松發(fā)生。

綜上所述，F(xiàn)SHR基因多態(tài)性與女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生有密切聯(lián)系，臨床上可通過檢測(cè)FSHR基因型，對(duì)骨質(zhì)疏松做出初步預(yù)測(cè)，以便盡早干預(yù)和控制，對(duì)預(yù)防原發(fā)性骨質(zhì)疏松發(fā)生具有重要價(jià)值，同時(shí)為臨床治療骨質(zhì)疏松開辟新思路和視野，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。