續(xù)苓健骨方對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠miRNA表達(dá)譜的作用研究

李生強(qiáng) 陳賽楠 謝冰穎 陳娟 謝麗華 葉云金 黃景文 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥科學(xué)院骨質(zhì)疏松證候基因組學(xué)研究室，福建 福州 350003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)可造成骨折及骨折并發(fā)癥引起的殘疾甚至死亡，骨質(zhì)疏松的防治已成為老年人健康的重大課題。近年來(lái)，中藥治療骨質(zhì)疏松癥得到廣泛認(rèn)可。續(xù)苓健骨方是以中醫(yī)藥理論遣方用藥形成的治療OP的經(jīng)驗(yàn)方。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，續(xù)苓健骨方可提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度[1]，改善骨生物力學(xué)性能[2]，提升血鈣含量，降低血磷含量[3]，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了一定探索[4-5]。miRNA參與了骨的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝及藥物治療等各個(gè)過(guò)程[6-7]。本研究采用二代測(cè)序方法，對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠模型在續(xù)苓健骨方治療后進(jìn)行腰椎miRNA測(cè)序，探討小分子非編碼RNA在治療過(guò)程中的變化，為臨床應(yīng)用該方治療OP提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6月齡SPF級(jí)SD雌性大鼠18只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005，合格證編號(hào)：2007000530078。飼養(yǎng)于福建省中醫(yī)藥科學(xué)院比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK(閩)2016-0005。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：續(xù)苓健骨方(國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利號(hào)ZL201510784227.4)由川續(xù)斷、白術(shù)、陳皮、赤芍、紅花、甘草等12味中藥組成，共122 g/劑。中藥飲片購(gòu)自福建省醫(yī)藥公司，按傳統(tǒng)中藥煎熬方法，每劑取汁 81.33 mL，生藥含量為1.5 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。大鼠灌胃量?jì)算方法：按成人50 kg：122/50=2.44 g/(kg·d)，大鼠灌胃量：2.44×6.25倍=15 g/kg。

文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序相關(guān)試劑：NEB Next?Poly(A) mRNA 磁性分離模塊、NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set(美國(guó)New England Biolabs公司)；RiboZero Magnetic Gold Kit (Human/Mouse/Rat) (美國(guó)Epicentre公司)；TruSeq Rapid SR Cluster Kit (#GD-402-4001，美國(guó)Illumina公司)。

1.1.3儀器：Discovery W 雙能 X 線骨密度儀(變異系數(shù)1.0 CV%，精度0.25%，美國(guó)Hologic 公司)；NanoDrop ND-1000(美國(guó)Thermal Scientific公司)；生物芯片分析系統(tǒng)Agilent 2100 Bioanalyzer(美國(guó)Agilent公司)；Illumina NextSeq 500 測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、造模及給藥：大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成3組：假手術(shù)組、模型組及續(xù)苓健骨方組，每組6只。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]造模。術(shù)后 30 d 開(kāi)始灌胃給藥，續(xù)苓健骨方 15 g/kg，上午灌胃；假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水 15 g/kg，連續(xù)給藥12周。各組動(dòng)物均普通飼料飼養(yǎng)，自由飲水和活動(dòng)。

1.2.2取材：最后一次灌胃完成2 h后，以10%水合氯醛麻醉后，取左側(cè)脛骨和第一、二腰椎。脛骨用于骨密度檢測(cè)；每組隨機(jī)選3只大鼠腰椎用于提取RNA及測(cè)序。

1.2.3骨密度檢測(cè)：采用雙能X線骨密度儀測(cè)定各組大鼠左側(cè)脛骨骨密度，操作過(guò)程嚴(yán)格按儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4樣品RNA提取及質(zhì)檢：從大鼠第一腰椎提取總 RNA，Nanodrop ND-1000測(cè)定RNA 260/280的濃度及蛋白質(zhì)污染情況，采用變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA純度及完整性。

1.2.5文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序：構(gòu)建好文庫(kù)，用Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行文庫(kù)質(zhì)量測(cè)定，混合好的不同樣品的測(cè)序文庫(kù)，通過(guò)0.1 M NaOH變性生成單鏈DNA，然后在Illumina NextSeq 500測(cè)序儀上進(jìn)行51循環(huán)測(cè)序。文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序均委托上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿伞?/p>

1.2.6測(cè)序數(shù)據(jù)分析：采用 miRDeep2 0.0.8 reads 軟件把trimmed miRNA 進(jìn)行已知 miRNA定量和新miRNA預(yù)測(cè)。使用R軟件edgeR 3.18.1進(jìn)行差異表達(dá)計(jì)算，篩選差異miRNAs，在線VENNY2.1分析共同差異miRNAs。利用miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)計(jì)top10差異miRNA的靶基因，并進(jìn)行靶基因GO功能顯著性富集分析、靶基因Pathway顯著性富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用edgeR篩選差異表達(dá)miRNA時(shí)，設(shè)定閾值為1.5倍差異，P<0.05且組內(nèi)CPM均值≥1。采用 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布，選擇非參數(shù)檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)比較組間差異，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠脛骨骨密度比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠骨密度顯著下降(P<0.01)；續(xù)苓健骨方組骨密度較模型組顯著提高(P<0.01)；續(xù)苓健骨方組與假手術(shù)組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠脛骨骨密度值比較

2.2 miRNA表達(dá)譜組間差異分析

各組之間差異miRNAs數(shù)見(jiàn)表2。VENNY 2.1在線進(jìn)一步分析模型組與假手術(shù)組的差異表達(dá)基因在續(xù)苓健骨方組中表達(dá)情況。模型組表達(dá)上調(diào)，在續(xù)苓健骨方組表達(dá)下調(diào)的miRNAs有50條；模型組表達(dá)下調(diào)，在續(xù)苓健骨方組表達(dá)上調(diào)的miRNAs有60條，即模型組共有110條異常表達(dá)的miRNAs在續(xù)苓健骨方組得到糾正。表3列出了這110條差異miRNAs中，續(xù)苓健骨方治療之后上調(diào)或下調(diào)的top 10 miRNAs，它們?cè)诩偈中g(shù)組、模型組、續(xù)苓健骨方組的表達(dá)變化及其已知功能。

表2 組間差異miRNA數(shù)比較

表3 前10位差異表達(dá) miRNAsTable 3 Top 10 of differential expressed miRNAs

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miRNAs表達(dá)

根據(jù)miRNA測(cè)序的結(jié)果，從表3中隨機(jī)選取了4個(gè)miRNA進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證，內(nèi)參選擇 snRNA U6。結(jié)果表明，rno-miR-136-3p、rno-miR-26b-5p在模型組中顯著提高(P<0.01)，在續(xù)苓健骨方組中顯著下降(P<0.01)；rno-miR-485-5p、rno-miR-138-5p在模型組中顯著降低(P<0.01)，在續(xù)苓健骨方組中顯著上升(P<0.01)。定量PCR的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致(圖1)。

圖1 定量PCR驗(yàn)證部分測(cè)序結(jié)果Fig.1 Partial sequencing results verified by real-time PCR注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，?P<0.01

2.4 差異miRNAs靶基因預(yù)測(cè)及GO富集分析

基于miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，從110條miRNA中選擇經(jīng)過(guò)續(xù)苓健骨方治療后上調(diào)或及下調(diào)的top 10 miRNAs，進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，然后對(duì)靶基因進(jìn)行Gene Ontology(GO)分析，包括分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組成(cellular component，CC)及參與的生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)。圖2分別列出了差異最顯著的前10個(gè)GO條目。這些靶基因參與了蛋白結(jié)合、多肽結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子活性等過(guò)程。

圖2 GO分析柱形圖 A：表達(dá)上調(diào)miRNAs靶基因參與的GO分析；B：表達(dá)下調(diào)miRNAs靶基因參與的GO分析Fig.2 Column map of enrichment analysis. A: Go analysis of target genes involved in up regulated miRNAs; B: Go analysis of target genes involved in down regulated miRNAs.

2.5 差異miRNAs靶基因信號(hào)通路分析

根據(jù)預(yù)測(cè)的靶基因，用其在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行信號(hào)通路分析。分別選取前10個(gè)信號(hào)通路，根據(jù)P值繪制成柱狀圖(圖3)。表達(dá)上調(diào)的miRNA的靶基因參與的信號(hào)通路包括甘油磷脂代謝通路、磷脂酰肌醇信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、Hedgehog信號(hào)系統(tǒng)、細(xì)胞內(nèi)吞信號(hào)通路等；表達(dá)下調(diào)的miRNA的靶基因參與的信號(hào)通路主要包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工信號(hào)通路、谷氨酸突觸信號(hào)通路、GnRH信號(hào)通路、自噬調(diào)節(jié)、CAMP及MAPK等信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路很可能參與了續(xù)苓健骨方治療骨質(zhì)疏松模型大鼠的治療過(guò)程。

2.6 預(yù)測(cè)新的miRNAs

通過(guò)使用Dicer對(duì)miRNA前體處理的簡(jiǎn)單模型，miRDeep2預(yù)測(cè)新的miRNAs。表4列出了miRDeep2得分最高的10個(gè)新miRNAs。

圖3 KEGG信號(hào)通路分析 A：表達(dá)上調(diào)miRNAs靶基因參與的信號(hào)通路；B：表達(dá)下調(diào)miRNAs靶基因參與的信號(hào)通路Fig.3 Pathway analysis on KEGG. A: signaling pathways involved in up regulated miRNAs; B: signaling pathways involved in down regulated miRNAs

表4 新miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)展示Table 4 Display of expression data of new miRNAs

3 討論

中醫(yī)藥治療骨質(zhì)疏松的miRNA表達(dá)譜的研究較少。趙清等[20]應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)中藥骨康治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)SD大鼠血漿miRNAs，認(rèn)為差異miRNAs可能在PMOP發(fā)生發(fā)展以及中藥治療中起重要的調(diào)控作用。嚴(yán)芳娜[21]用miRNA芯片檢測(cè)黃精多糖對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞和骨髓源性單核巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞過(guò)程中miRNAs表達(dá)譜的變化，認(rèn)為miRNA的表達(dá)對(duì)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞均有重要作用。陳哲[22]運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)并qPCR驗(yàn)證滋腎降糖丸可能通過(guò)miRNAs對(duì)Wnt通路進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而影響成骨分化、實(shí)現(xiàn)防治糖尿病骨質(zhì)疏松的作用。

本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，續(xù)苓健骨方組大鼠骨密度則顯著提升。從差異miRNAs來(lái)看，續(xù)苓健骨方對(duì)在模型組出現(xiàn)異常表達(dá)的miRNAs起了較好的恢復(fù)作用。經(jīng)12周的治療后，共有110條miRNAs的異常表達(dá)得到糾正。與假手術(shù)組相比，續(xù)苓健骨方組僅有8個(gè)異常表達(dá)的miRNAs，這表明無(wú)論是骨密度還是miRNA層面，續(xù)苓健骨方對(duì)骨質(zhì)疏松癥均具有良好的治療作用。

在篩選到的差異miRNAs中，許多miRNAs均與骨質(zhì)疏松癥或骨代謝密切相關(guān)，如Chen等[11]發(fā)現(xiàn)miRNA-136-3p在酒精誘導(dǎo)的小鼠骨量減少模型中的表達(dá)顯著降低，而且它能靶向PTEN調(diào)節(jié)血管生成和骨形成并改善酒精誘導(dǎo)的骨量減少。Panach等[23]從臨床患者血液中篩選到miR-122-5p，定量PCR證明其與骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)；Mandourah等[13]采用芯片從臨床患者外周血篩選到差異表達(dá)miR-122-5p，定量PCR驗(yàn)證它與低骨密度及脆性骨折相關(guān)，認(rèn)為是一個(gè)潛在的診斷標(biāo)記物；Liao等[24]也發(fā)現(xiàn)miR-122-5p負(fù)性調(diào)控SPRY2，升高受體酪氨酸激酶(RTK)活性，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松癥患者中miR-485-5p表達(dá)水平上調(diào)，而在成骨分化過(guò)程中，miR-485-5p受到抑制，后又通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)及熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)miR-485-5p靶向Ostex促進(jìn)骨質(zhì)疏松。此外，本文在測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)軟件預(yù)測(cè)得到了高信度的新miRNAs，不過(guò)其具體功能還有待進(jìn)一步深入研究。

miRNA是機(jī)體重要的調(diào)控體系，對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控是miRNA發(fā)揮作用的重要方式。本研究對(duì)top10差異miRNA的靶基因進(jìn)行信號(hào)通路分析，發(fā)現(xiàn)靶基因參與HIF-1、甲狀腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、cAMP及MAPK等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路均參與了骨代謝的過(guò)程。

綜上所述，本研究采用Illumina測(cè)序結(jié)合生物信息學(xué)分析，建立了卵巢切除大鼠模型骨組織miRNA表達(dá)譜，分析了續(xù)苓健骨方對(duì)骨質(zhì)疏松模型大鼠腰椎miRNAs作用，篩選出差異表達(dá)miRNAs。top10 miRNAs靶基因參與了蛋白結(jié)合、多肽結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄因子活性等生物學(xué)過(guò)程，及HIF-1、甲狀腺激素、Hedgehog、GnRH、自噬、cAMP及MAPK等信號(hào)通路，對(duì)于從miRNA角度探討骨質(zhì)疏松癥的形成及中藥治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制具有重要參考價(jià)值。