酶菌聯(lián)合處理玉米蛋白粉制備高蛋白原料的研究

陳國(guó)明 史路路 張家學(xué) 齊振雄

(廣東海大集團(tuán)股份有限公司畜牧水產(chǎn)研究中心海大中央研究院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生態(tài)資源養(yǎng)殖利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州511400)

玉米蛋白粉是玉米濕法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量約60%，其余約為20%的淀粉和少量酯類、玉米黃素、葉黃素等[1]，具有蛋白含量高、低纖維素、富含維生素B 和維生素E、不含抗?fàn)I養(yǎng)因子等諸多優(yōu)點(diǎn)[2]。玉米蛋白粉是一種非全價(jià)蛋白質(zhì)，目前主要用于飼料處理，在水產(chǎn)畜禽上都有較好的應(yīng)用效果。Arash等[3]試驗(yàn)證明配方中添加一定比例的玉米蛋白粉能有效地改善肉仔雞的生長(zhǎng)性能，飼料中添加12%的玉米蛋白粉，肉仔雞的體重增長(zhǎng)最快。朱磊等[4]研究表明，在黃顙魚擠壓膨化飼料中可以使用6%的玉米蛋白粉，能夠維持黃顙魚的正常生產(chǎn)性能和正常生理功能。程媛媛等[5]研究表明，用5%玉米蛋白粉替代飼料中9.10%魚粉，配制等氮等能的試驗(yàn)飼料，飼養(yǎng)羅氏沼蝦53 d 后，得出5%玉米蛋白粉組蝦的生長(zhǎng)和飼料利用與對(duì)照組無(wú)顯著差異（P>0.05）。由于玉米蛋白粉中含有一定量的碳水化合物，這限制玉米蛋白粉在高檔水產(chǎn)料飼料中的用量。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)的研究主要集中在提升玉米蛋白粉蛋白溶解度和多肽得率，在提高蛋白含量方面的研究較少。本試驗(yàn)從提升蛋白質(zhì)含量的角度出發(fā)，通過(guò)以酵母菌、糖化酶、淀粉酶協(xié)同處理的方式進(jìn)行固體發(fā)酵，并通過(guò)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，以期提高玉米蛋白粉蛋白與氨基酸含量，制備出一種高蛋白飼料原料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品及菌株來(lái)源

玉米蛋白粉：由海維飼料有限公司贈(zèng)送；釀酒酵母：自制活菌數(shù)為150 億cfu/g 的活性干酵母，菌種來(lái)源于海大研究院菌種庫(kù)；糖化酶和淀粉酶：購(gòu)于尤特爾生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；凱氏定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；水浴鍋（常州國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所）；恒溫?fù)u床（太倉(cāng)市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；pH計(jì)（上海三信儀表廠）；滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

玉米蛋白粉200 g，料水比為1：0.7，用碳酸鈉調(diào)pH 值至6.5，糖化酶與底物比為0.4%，淀粉酶與底物比為0.2%，酵母菌接種量0.3%，接種、攪拌均勻后用PE 袋密封包裝，置于培養(yǎng)箱中發(fā)酵，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間24 h。在上述各單因素的基礎(chǔ)上，對(duì)需要研究的單因素進(jìn)行不同水平的調(diào)整，分別為：糖化酶與底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、淀粉酶與底物比（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酵母菌接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、料水比例（1：0.5、1：0.6、1：0.7、1：0.8）、發(fā)酵溫度（25、30、35、40、45 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（8、16、24、32、40、48 h）、初始pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5），每組進(jìn)行3 個(gè)平行試驗(yàn)。樣品在60 ℃下烘干4 h，粉碎。測(cè)定含水量及蛋白質(zhì)含量，根據(jù)蛋白質(zhì)含量來(lái)確定單因素試驗(yàn)的最佳條件。

1.2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定影響較為顯著的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

①水分：GB/T 6435—2006飼料中水分和其他揮發(fā)性物質(zhì)含量的測(cè)定。

②蛋白含量：凱氏定氮法，按照GB/T 5009.5—2010方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果為風(fēng)干基礎(chǔ)，水分12%(與玉米蛋白粉原料水分保持一致)。

③氨基酸：酸解法，參照GB/T 18246—2000進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用Microsoft Excel與SPSS 23.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 糖化酶底物比對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖1)

圖1 糖化酶底物比對(duì)發(fā)酵效果的影響

糖化酶能在淀粉鏈的非還原性末端切開α-1-4鍵處，也能緩慢切開a-1-6鍵，把直鏈淀粉、支鏈淀粉水解成葡萄糖，供酵母菌生長(zhǎng)利用，進(jìn)而提高蛋白含量。其添加量過(guò)少達(dá)不到最佳效果，添加過(guò)多又會(huì)造成資源的浪費(fèi)。由圖1 結(jié)果可見，糖化酶底物比為0.1%～0.4%時(shí)，發(fā)酵后蛋白含量隨著糖化酶底物比的加大而增高，繼續(xù)增大加酶量，發(fā)酵后蛋白不再增加。綜上可見，選擇0.4%的糖化酶底物比最為合適，此時(shí)發(fā)酵后的蛋白達(dá)到73.05%。

圖2 淀粉酶底物比對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.1.2 淀粉酶底物比對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖2)淀粉酶能把玉米蛋白粉中的淀粉水解成糊精和糖，與糖化酶搭配使用，強(qiáng)化效果。淀粉酶不同底物比所對(duì)應(yīng)的蛋白變化規(guī)律與糖化酶的效果類似，確定最適的淀粉酶底物比為0.2%。

圖3 酵母菌接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.1.3 酵母菌接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖3)酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中可以利用淀粉轉(zhuǎn)化而成的糖類，還可以轉(zhuǎn)化成豐富的菌體蛋白，最終達(dá)到濃縮蛋白的目的。由圖3 可見，酵母菌接種量在0.1%～0.3%時(shí)，隨著酵母菌接種量的增加，發(fā)酵后蛋白含量也隨之增加，當(dāng)接種量達(dá)到0.4%以后，蛋白含量不再增加，因此最合適的接種量為0.3%。

圖4 料水比對(duì)發(fā)酵效果的影響

2.1.4 料水比對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖4)固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)中少量的水分能夠溶解菌體生長(zhǎng)繁殖所需要的一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物，有利于促進(jìn)微生物生長(zhǎng)，水分過(guò)少易導(dǎo)致物料干結(jié)而使微生物生長(zhǎng)緩慢，而過(guò)高又會(huì)使發(fā)酵基質(zhì)黏著成團(tuán)，并且容易使物料感染雜菌、發(fā)霉變質(zhì)。由圖4 的結(jié)果可見，發(fā)酵時(shí)的水分越高，發(fā)酵后蛋白含量也越高，但差距不大，考慮到發(fā)酵后烘干的成本，因此選擇1：0.7 的料水比較適合。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖5)

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵時(shí)間過(guò)短，菌的代謝及對(duì)糖分的利用還不充分，發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)又造成資源的浪費(fèi)，且容易滋生雜菌。由圖5可見，發(fā)酵24 h內(nèi)樣品的蛋白隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，24 h 后蛋白含量趨于穩(wěn)定，發(fā)酵24 h時(shí)蛋白含量即可達(dá)到73%以上，因此發(fā)酵24 h較為合適。

2.1.6 溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖6)

溫度是微生物和酶制劑發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素之一。溫度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)影響到最終處理效果。由圖6可知，最適的處理溫度為35 ℃。在35 ℃處理時(shí)，蛋白含量可以提升至72%以上。

2.1.7 pH值對(duì)發(fā)酵效果的影響(見圖7)

圖6 溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

圖7 pH值對(duì)發(fā)酵效果的影響

pH 值同樣影響著菌的生長(zhǎng)與酶的作用。通過(guò)不同pH 值發(fā)酵試驗(yàn)，得出合適的發(fā)酵pH 值范圍是6.0～7.0，最適發(fā)酵pH 值是6.5，發(fā)酵后蛋白含量達(dá)到73%，當(dāng)pH 值偏酸或偏堿時(shí)，發(fā)酵后蛋白含量相對(duì)較低。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選定了糖化酶底物比、淀粉酶底物比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行最佳發(fā)酵條件的研究，以發(fā)酵后的蛋白含量為考察指標(biāo)。

由表2 正交試驗(yàn)分析，比較各因素對(duì)蛋白含量的極差大小及平均值，可知不同參數(shù)對(duì)蛋白含量影響由大到小為RA>RC>RB>RD，其中糖化酶的底物比對(duì)發(fā)酵的影響最顯著，得出發(fā)酵的最優(yōu)因素組合為A3B2C2D2，即最適合添加量組合是糖化酶0.4%、淀粉酶0.2%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間24 h。在此條件下對(duì)最優(yōu)條件進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證，得到蛋白含量為73.08%。

2.3 發(fā)酵前后氨基酸的變化(見表3)

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

糖化酶、淀粉酶與酵母菌聯(lián)合發(fā)酵后氨基酸含量的變化較大，發(fā)酵后總氨基酸含量由62.61%提高至76.61%，提高了22.36%，不同的氨基酸都有一定程度的含量提升，尤其是必需氨基酸，除色氨酸和賴氨酸外，其他6種氨基酸提升率都達(dá)到20%以上。

3 討論

玉米蛋白粉中含有15%～21%的淀粉，通過(guò)復(fù)合酶與微生物的聯(lián)合作用，進(jìn)行一系列的降解與轉(zhuǎn)化，最終達(dá)到蛋白濃縮的目的。本研究以密封厭氧發(fā)酵的方式進(jìn)行發(fā)酵，不需要另外控制發(fā)酵環(huán)境的濕度，避免發(fā)酵過(guò)程水分的損失而影響酶解效果，另外酵母菌屬于兼性厭氧菌，也可以在厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)。通過(guò)添加糖化酶與淀粉酶可以將玉米蛋白粉中的淀粉水解，水解得到的糖類再被酵母菌代謝利用，進(jìn)而可以濃縮提高蛋白含量，優(yōu)化發(fā)酵條件后得到蛋白含量73%以上、氨基酸含量76%以上的高蛋白飼料原料。盡管通過(guò)酶解或微生物發(fā)酵可以全面提升玉米蛋白粉的水解度、蛋白、氨基酸等指標(biāo)，但是發(fā)酵后的賴氨酸和色氨酸仍然較低，使發(fā)酵玉米蛋白粉作為高蛋白飼料原料受到一定的限制。目前的研究主要是通過(guò)添加游離氨基酸或與其他蛋白源來(lái)混合使用，饒春鳳等研究玉米蛋白粉替代魚粉對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響，得出飼料中補(bǔ)充賴氨酸和蛋氨酸，可提高玉米蛋白粉在凡納濱對(duì)蝦飼料中的替代比例，其替代魚粉蛋白比例可以提高到15%，占飼料比例的4.5%[6]。在必需氨基酸方面，玉米蛋白粉所含氨基酸總量大于大豆粉和魚粉，其中總含硫氨基酸和亮氨酸含量高于大豆粉和魚粉，但賴氨酸及色氨酸含量較低，可與大豆粉和魚粉的蛋白源相互補(bǔ)充[7]。盡管對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物能否能真正利用游離氨基酸還存在爭(zhēng)議，但是在玉米蛋白粉飼料中添加游離氨基酸起到了比較積極的效果[8]。因此，怎樣改善氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，怎樣與其他蛋白源科學(xué)搭配互補(bǔ)，仍然是發(fā)酵玉米蛋白粉值得探討之處。

表3 發(fā)酵前后氨基酸含量的變化（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以提升蛋白，制備高檔水產(chǎn)飼料的高蛋白原料為出發(fā)點(diǎn)，以糖化酶、淀粉酶與酵母菌聯(lián)合進(jìn)行玉米蛋白粉密封厭氧固體發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，得出最佳發(fā)酵條件為：糖化酶底物比0.4%、淀粉酶底物比0.2%、酵母菌接種量0.3%，料水比1：0.7、溫度35 ℃、起始pH 值6.5、密封發(fā)酵時(shí)間24 h，發(fā)酵及酶解處理后樣品的蛋白提升至73.08%，提高21.80%，總氨基酸與總必需氨基酸分別提高22.36%、23.60%。