老年肺癌組織中EGFR突變的影響因素分析及與腫瘤病理學(xué)研究

陳輝娥 姜訓(xùn)忠 聶 鴻 李延?xùn)| 周 芳 潘 琪

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，隨著老齡化社會(huì)加重，近些年肺癌發(fā)病率逐年升高，居我國(guó)癌癥死亡率首位，是老年人死亡原因首位，其中80%為非小細(xì)胞肺癌，多數(shù)就診時(shí)已處于晚期[1]。雖然臨床上治療肺癌方法較多，如傳統(tǒng)手術(shù)、放療、化療等，然而這些方法效果均差，隨著分子生物學(xué)發(fā)展和靶向治療進(jìn)展，EGFR靶向治療取得重大突破。廖志文[2]報(bào)道稱酪氨酸激酶抑制劑能顯著延長(zhǎng)患者生存期。EGFR為酪氨酸激酶受體家族，是1種跨膜蛋白，由細(xì)胞外配體結(jié)合域、疏水跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域組成，能和配體結(jié)合營(yíng)銷細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶磷酸化、下游信號(hào)通路激活和適配器分子作用，從而參與細(xì)胞增殖、分化和血管形成、轉(zhuǎn)移。EGFR突變主要發(fā)生在編碼細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域18-21外顯子，最常見突變部位為19外顯子和21外顯子L858R點(diǎn)突變。因EGFR突變后不依賴配體結(jié)合激活酪氨酸激酶磷酸化，會(huì)自動(dòng)啟動(dòng)下游信號(hào)通路，造成腫瘤復(fù)發(fā)[3]。報(bào)道[4]指出，EGFR突變和性別、種族、吸煙、病理類型均有關(guān)，而在檢測(cè)中以肺癌組織特異性、敏感度最高，常作為其他標(biāo)本對(duì)比檢測(cè)結(jié)果金標(biāo)準(zhǔn)。肺癌組織標(biāo)本獲取依賴手術(shù)、支氣管鏡或穿刺等，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，肺癌組織獲取度相對(duì)較易?；虼?，本次研究總結(jié)老年EGFR突變影響因素及與腫瘤病理學(xué)特征相關(guān)性，以期針對(duì)性治療，提高療效。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2016年06月至2019年01月收治的共264例肺癌組織樣本。年齡60～85歲，平均(64.65±2.68)歲；男性154例、女性110例；吸煙史：有106例、無158例；病理類型：腺癌191例、鱗癌45例、大細(xì)胞癌20例、小細(xì)胞癌8例。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡60～85歲；②均簽署知情同意書；③檢查前未行放化療；④依次性好，能配合完成問卷調(diào)查。⑤均經(jīng)組織病理學(xué)確診。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡<60歲；②無法進(jìn)行操作無法獲取肺癌組織標(biāo)本者；③特殊人群，如精神病，嚴(yán)重肝功能損害、心血管意外不能耐受調(diào)查治療者。④病理資料不完整。

1.4 研究方法

由上海強(qiáng)生檢驗(yàn)中心進(jìn)行檢測(cè)，將收集的肺癌組織取約5 g進(jìn)行檢測(cè)，先將組織研磨好后加入細(xì)胞裂解液5 ml，室溫下放置30 min，以3 000 r/min離心5 min。1 ml裂解液中加入0.2 ml氯仿進(jìn)行裂解。采用無酶RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次離心5 min。將以上混合液加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV，在70 ℃下干浴3 min。再加入逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl，在恒溫下水浴1 h，室溫放置5 min促使其溶解轉(zhuǎn)錄為cDNA。再在反應(yīng)體系中加入SYBR Green染料，經(jīng)正向、反向引物后上機(jī)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)操作。操作條件為93 ℃ 2 min和1 min，再55 ℃ 2 min。使用由江蘇蓋爾克生物科技有限公司提供的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增基因多態(tài)性檢測(cè)，加入對(duì)應(yīng)延伸引物進(jìn)行單堿基測(cè)序反應(yīng)。使用PCR引物軟件進(jìn)行檢測(cè)。

在突變率上從臨床病理類型比較，在浸潤(rùn)程度上根據(jù)肺腺癌進(jìn)行對(duì)比。在影響因素上從吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、胸膜侵犯、性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、基礎(chǔ)疾病、病程、家族史、既往肺部疾患等進(jìn)行比較，多因素采用非條件Logistic回歸分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

對(duì)文中所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件處理，組間資料采用卡方檢測(cè)，單影響因素采用Kaplan-Meier法檢測(cè)，多因素采用非條件Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理類型EGFR突變比較

不同病理類型肺癌組織中，腺癌EGFR突變率57.59%，遠(yuǎn)高于其他病理類型比率(P<0.05)，在肺腺癌浸潤(rùn)程度中，浸潤(rùn)性肺腺癌EGFR突變率66.9%，遠(yuǎn)高于其他浸潤(rùn)程度肺腺癌(P<0.05)，見表1，表2。

表1 不同病理類型肺癌組織中EGFR突變情況比較(例，%)

表2 肺腺癌浸潤(rùn)程度EGFR突變比較(例，%)

2.2 老年肺癌組織EGFR突變影響因素比較

老年肺癌組織EGFR突變單危險(xiǎn)影響因素有吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、胸膜侵犯、女性(P<0.05)，而與年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、基礎(chǔ)疾病、病程、家族史、既往肺部疾患無關(guān)(P>0.05)，見表3。

表3 老年肺癌組織EGFR突變影響因素比較(例，%)

2.3 EGFR突變獨(dú)立影響因素分析

經(jīng)非條件Logistic回歸分析，吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、胸膜侵犯、女性是老年肺癌組織EGFR突變獨(dú)立影響因素(P<0.05)，見表4。

3 討論

肺癌是我國(guó)老年人發(fā)病率和死亡率最高惡性腫瘤，發(fā)病率為73.3/10萬，標(biāo)化病死率為誒39.8/10萬，其中有80%肺癌為吸煙所致，在病理類型上以腺癌最常見[5]。因肺癌早期缺乏典型臨床癥狀，80%患者就診時(shí)已經(jīng)處于晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)，放化療是目前肺癌主流治療手段。但隨著靶向治療逐步發(fā)展，其針對(duì)性強(qiáng)、有效期高、緩解期長(zhǎng)、不良反應(yīng)小是EGFR治療優(yōu)勢(shì)所在。但隨著臨床運(yùn)用，EGFR突變成為影響其療效的重要因素，不僅降低療效，且EGFR突變后影響機(jī)體免疫功能，進(jìn)一步降低患者生活質(zhì)量，故逐漸引起臨床重視。

報(bào)道[6-7]將EGFR作為肺癌治療靶點(diǎn)，以求通過作用于細(xì)胞內(nèi)活性氧或一氧化氮生成EGFR抑制肺癌細(xì)胞增殖和分化；或是促進(jìn)EGFR配體表達(dá)上調(diào)從而導(dǎo)致EGFR過度激活，影響EGFR構(gòu)象或激酶結(jié)構(gòu)域，通過細(xì)胞膜影響EGFR分布情況，也能誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和內(nèi)皮網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)嗎，從而抑制EGFR激活。

在影響因素上，吸煙是獨(dú)立影響因素，因煙草中含有亞硝酸鹽類物質(zhì)，這類物質(zhì)可通過BaP細(xì)胞色素P450s酶系催化代謝重要產(chǎn)物，其能和核酸堿基和蛋白質(zhì)氨基酸殘基親核基團(tuán)共價(jià)結(jié)合形成合物導(dǎo)致DNA損傷[8]。煙草中丁酮、n=亞硝基甲氨基能轉(zhuǎn)移DNA和蛋白質(zhì)等分子形成加合物，直接引起基因DNA損傷，導(dǎo)致基因突變、染色體畸變、細(xì)胞死亡，誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展。而在臨床分期上Ⅲ～Ⅳ期為獨(dú)立危險(xiǎn)因素，因EGFR可通過絡(luò)氨酸磷酸化促進(jìn)癌細(xì)胞膜糖蛋白激活，促進(jìn)癌細(xì)胞周期性調(diào)控，從而依賴性激活蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯，增加G1/S期比率，降低G0細(xì)胞數(shù)量[9]。其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上主要原因是EGFR能對(duì)癌細(xì)胞病灶組織局部新生血管發(fā)揮促進(jìn)作用，能提高局部腫瘤組織血流灌注，增加癌細(xì)胞浸潤(rùn)和擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)性。對(duì)胸膜侵犯是獨(dú)立因素是因?yàn)镋GFR蛋白能降低細(xì)胞間錨合、縫隙、緊密連接，可下調(diào)細(xì)胞基底膜完整性，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)。研究[10]指出，女性對(duì)EGFR突變者19外顯子的抑制作用較EGFR外顯示21強(qiáng)，19外顯子連接蛋白磷酸化在一定程度上修飾殘基結(jié)合，導(dǎo)致EGFR降解減少，其銜接蛋白磷酸化下降EGFR-1173殘基結(jié)合，導(dǎo)致RAS通路活性下降。而在性別因素上以女性較多，這點(diǎn)在臨床上缺乏大量依據(jù)，結(jié)合現(xiàn)代理化因素，可能和女性使用化學(xué)物質(zhì)有關(guān)，因化妝品中含量微量金屬元素，而這些元素能激活EGFR賴氨酸激活酶活性，下降MEK-1，如釩可引起Ras醫(yī)療絲氨酸磷酸化，促進(jìn)DNA和NF結(jié)合。鋅則能通過c-src激酶而不依賴EGFR聚集和自身激酶活性[11]。

表4 老年肺癌組織EGFR突變獨(dú)立影響因素分析

連亞莉[12]指出，EGFR突變對(duì)淋巴結(jié)浸潤(rùn)影響是和淋巴結(jié)黏附因子表達(dá)有關(guān)，而在臨床分期上主要是癌細(xì)胞變形能力、浸潤(rùn)能力和對(duì)基底膜組織突破力有關(guān)。馬曉燕[13]則通過對(duì)比EGFR突變類型，從性別、年齡、病理類型、TMN分期、腦轉(zhuǎn)移、放療、化療等進(jìn)行歸納，比較19/21外顯子在療效上區(qū)別情況，從而總結(jié)出19外顯子EGFR突變預(yù)后更好。孫曉遠(yuǎn)[14]則通過對(duì)比EGFR突變型和EGFR野生型，從而對(duì)比其在無進(jìn)展生存期和總生存期變化情況，旨在說明EGFR對(duì)生存期影響價(jià)值。而本次研究從淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胸膜侵犯等角度進(jìn)行歸納，旨在說明EGFR突變對(duì)療效影響性，歸納因素符合肺癌晚期臨床特征，實(shí)用性強(qiáng)，但本次研究中未對(duì)EGFR突變類型和影響因素進(jìn)行匹配，同時(shí)未將治療方案和EGFR突變之間進(jìn)行對(duì)比，對(duì)臨床指導(dǎo)價(jià)值仍有待提高，仍有進(jìn)一步探討空間。