許前進 楊景峰 國 擎
乳腺癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,該病多見于中成年女性。隨著檢測技術(shù)的提高,乳腺癌在我國呈現(xiàn)發(fā)病率增高及年輕化的趨勢[1]。手術(shù)為該病的首選治療方法,但是中晚期乳腺癌的臨床預(yù)后比較差,基本失去了手術(shù)指征,導(dǎo)致5年生存率低[2-3]。因此進一步研究乳腺癌的發(fā)病機制,尋找治療乳腺癌新的治療靶點具有重要價值?,F(xiàn)代研究表明腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是1個復(fù)雜的分子調(diào)控失控過程,涉及到細胞信號傳導(dǎo)異常、細胞基質(zhì)間黏附障礙、癌基因激活、抑癌基因失活等[4-5]。miRNAs是1組內(nèi)源性小的非編碼RNA,廣泛存在于真核生物中,可通過轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達或通過結(jié)合特定目標(biāo)基因的3’末端非翻譯區(qū)域來發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[6]。當(dāng)前也有研究表明,miRNAs表達在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[7]。miR-543作為miRNAs家族的一員,在結(jié)腸癌、膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)發(fā)揮致癌基因作用[8-9]。乳腺癌組織miR-543的表達較正常子宮內(nèi)膜組織明顯降低,可發(fā)揮抑癌基因作用[10],但是具體的作用機制還不明確。B細胞特異性小鼠白血病病毒插入位點1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1,Bmi-1)屬于多梳基因單位,可直接調(diào)節(jié)細胞生長、增殖,也可通過調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化來調(diào)節(jié)基因活性[11]。具體探討了miR-543對乳腺癌細胞的增殖和侵襲的影響,并明確了其作用機制,希望為乳腺癌的靶向治療提供新的方向?,F(xiàn)總結(jié)報告如下。
人乳腺癌細胞(MDA-MB-468)購自于上海中科院細胞庫,0.25%胰蛋白酶Invitrogen公司,RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司,胎牛血清購自Sciencell公司,miR-543 mimics與mimics NC購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。
MDA-MB-468細胞與Hela細胞均采用RPMI-1640培養(yǎng)基,添加10%胎牛血清,含100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素的混合液進行培養(yǎng),培養(yǎng)條件:37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱,每1~2天傳代一次。取對數(shù)生長期的MDA-MB-468細胞分為三組-對照組、miR-543組與空白組。對照組、miR-543組分別轉(zhuǎn)染mimics NC與miR-543 mimics,轉(zhuǎn)染濃度為50 nM;空白組以等體積的磷酸鹽緩沖液進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h,將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔培養(yǎng)板。用250 μl RPMI1640培養(yǎng)基稀釋5 μl轉(zhuǎn)染試劑Lipo-2000,室溫下靜置5 min。然后用25 μl RPMI1640培養(yǎng)基稀釋5 μl mimics NC與miR-543 mimics,孵育5 min進行混勻,形成復(fù)合物,滴入RPMI1640培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)染后6 h換液1次,然后進行常規(guī)培養(yǎng)。
MDA-MB-468細胞接種密度為3×105細胞/孔,接種于無菌的96孔板中,轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng),然后每孔加入20 μl MTT試劑(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄去上清培養(yǎng)基,加入200 μl的DMSO,避光振蕩溶解10 min,采用測定吸光度值。細胞增殖指數(shù)=(實驗組吸光度值-空白組吸光度值)/(對照組吸光度值-空白組吸光度值)×100%。
收集1.3中轉(zhuǎn)染后的細胞,繼續(xù)進行常規(guī)培養(yǎng),采用凋亡試劑盒(Annexin-V/PI)進行避光染色1 h,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡指數(shù)。
收集1.3中轉(zhuǎn)染后的細胞,繼續(xù)培養(yǎng)后進行消化,按1×105細胞/孔接種在小室的上室中,體積為200 μl。Transwell小室下室加入750 μl含20%胎牛血清的RPIM 1640培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Tranawell小室,棄去小室液體,清洗2次后將小室置于甲醛溶液中固定15 min,再次洗滌后將小室放入0.1%結(jié)晶紫染色30 min,顯微鏡下觀察拍照,計算細胞轉(zhuǎn)移。在侵襲實驗中,實驗前1天將-20 ℃凍存的基質(zhì)膠置于室溫下溶解,Transwell小室經(jīng)消毒后放置在無菌24孔板中,小室內(nèi)加入基質(zhì)膠100 μl,常規(guī)進行培養(yǎng),后續(xù)處理同細胞轉(zhuǎn)移實驗,計算細胞侵襲指數(shù)。
收集1.3中轉(zhuǎn)染后的細胞,加入Trizol后提取細胞總RNA,采用Real-time quantitative PCR檢測miR-543表達水平,以U6作為內(nèi)對照組,在ABI 7500熒光定量PCR儀上,PCR反應(yīng)條件:95 ℃30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個循環(huán),計算miR-543相對表達水平。
收集1.3中轉(zhuǎn)染后的細胞,提取細胞總蛋白,跑SDS-PAGE膠,轉(zhuǎn)膜后采用Western Blotting法檢測Bmi-1表達水平,以β-actin作為內(nèi)對照組,采用ImageJ軟件測量蛋白灰度值并分析各組細胞目的蛋白相對表達量。
轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組miR-543相對表達水平顯著高于空白組與對照組(P<0.05),空白組與對照組對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表1。
轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組的細胞增殖指數(shù)顯著低于空白組與對照組(P<0.05),細胞凋亡指數(shù)顯著高于空白組與對照組(P<0.05),空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。
表1 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點的miR-543相對表達水平對比
表2 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點細胞增殖指數(shù)與凋亡指數(shù)對比
轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組的細胞轉(zhuǎn)移與侵襲指數(shù)都顯著低于空白組與對照組(P<0.05),空白組與對照組對比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。
表3 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點細胞轉(zhuǎn)移與侵襲指數(shù)對比
轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組的Bmi-1蛋白相對表達水平顯著低于空白組與對照組(P<0.05),空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。
表4 三組轉(zhuǎn)染后不同時間點Bmi-1蛋白相對表達水平
近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年增高,多數(shù)患者可在早期診斷,預(yù)后較好,5年生存率在80%以上。然而晚期與復(fù)發(fā)性乳腺癌的預(yù)后則比較差,5年生存率約為20%[12]。根治性手術(shù)是早期乳腺癌的1種有效治療方法,但是也有30%左右患者在術(shù)后可發(fā)生轉(zhuǎn)移,為此早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌增殖和侵襲的分子和信號通路具有重要價值[13-14]。
miRNAs是1種非編碼小RNA,通過抑制靶基因的表達,進而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為[15]。有研究顯示控制乳腺癌發(fā)生的miRNAs靶基因能調(diào)節(jié)乳腺癌的早期發(fā)展,且與腫瘤組織的血管生成、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖和侵襲等明顯相關(guān)[16-17]。miR-543位于染色質(zhì)19q13.42上,在乳腺癌、T細胞淋巴瘤、食管癌等組織中呈現(xiàn)異常表達情況,影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移[18-19]。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組的細胞增殖指數(shù)、細胞轉(zhuǎn)移與侵襲指數(shù)顯著低于空白組與對照組,細胞凋亡指數(shù)顯著高于空白組與對照組,空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明miR-543的過表達能抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲,促進細胞凋亡。而轉(zhuǎn)移與侵襲是乳腺癌預(yù)后不良的主要因素,也表明miR-543可為乳腺癌的診斷和治療提供了新的靶標(biāo)[20]。
腫瘤細胞的增殖和侵襲是惡性腫瘤的主要標(biāo)志及體現(xiàn),子宮基底層的侵襲程度是乳腺癌預(yù)后的主要因素之一,也是腫瘤患者發(fā)生癌變的主要因素之一[21]。miRNAs是約由22個核苷酸組成的短鏈非編碼RNAs,通過與靶向基因的mRNA序列互補結(jié)合來影響多種生物過程。既往研究發(fā)現(xiàn)miRNAs在子宮內(nèi)膜分泌期、增殖期、月經(jīng)期以及乳腺癌的發(fā)展過程中都可參與調(diào)控細胞的增生[22]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-543家族有抑癌作用,包括調(diào)節(jié)細胞分裂和凋亡、逆轉(zhuǎn)化療、抑制腫瘤干細胞的自我更新和分化等[23]。特別是miR-543能通過上調(diào)PTEN基因的表達,促進乳腺癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲,miR-543也能經(jīng)PETN-PI3K/AKT等信號通路在胃癌中抑制細胞增殖。miR-543在乳腺癌細胞中呈現(xiàn)低表達,上調(diào)miR-543 表達可顯著抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[24]。
早期研究顯示miRNAs可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子Bmi-1實現(xiàn)對惡性腫瘤細胞增殖及凋亡的調(diào)控[25-26],但是在乳腺癌細胞中的作用還不明確。本研究顯示轉(zhuǎn)染后24 h與36 h,miR-543組的Bmi-1蛋白相對表達水平顯著低于空白組與對照組,空白組與對照組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明隨著miR-543 表達的上調(diào),Bmi-1蛋白表達水平明顯降低,提示miR-543在乳腺癌細胞對Bmi-1 蛋白表達具有一定調(diào)控作用。不過miR-543 是否還可通過調(diào)控其他下游基因發(fā)揮作用仍有待進一步研究證實。
總之,miR-543在乳腺癌細胞中可抑制Bmi-1基因的表達,促進細胞凋亡,發(fā)揮抑制細胞增殖和侵襲的作用。