SAMC在體內(nèi)環(huán)境下通過干預(yù)MAPK與NF-κB信號通路發(fā)揮對乳腺癌的治療作用

陸 娟 馮晨露 趙旭林

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一。盡管中國女性乳腺癌的發(fā)病率及死亡率在全球范圍內(nèi)處于較低水平，但流行病學(xué)表明，國內(nèi)女性乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)迅速上升的趨勢，且發(fā)病年齡逐漸年輕化[1]。近年來，隨著對傳統(tǒng)中藥研究的不斷深入，越來越多的植物活性成分被發(fā)現(xiàn)。研究表明，大蒜素具有抗菌消炎、抗氧化以及抗腫瘤的作用，其中S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)是大蒜素復(fù)雜混合物中的主要活性成分之一[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，SAMC對包括大腸癌在內(nèi)的多種腫瘤均有抑制作用[3]，但是對乳腺癌的作用不甚明確，相關(guān)文獻較少。因此，本研究旨在觀察SAMC在體內(nèi)環(huán)境下對乳腺癌的抑制作用，并初步探討其可能的分子機制，為SAMC的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

人乳腺癌細胞MCF-7購自于中國科學(xué)院上海細胞庫，BALB/c雌性裸鼠購自于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，SAMC購自于昆明善利生物有限公司。

1.2 人乳腺癌細胞MCF-7的培養(yǎng)

使用DMEM/High Glucose配制細胞完全培養(yǎng)基(含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗)，將細胞放置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長狀態(tài)，約1～2天半量換液一次，待細胞生長至80%接觸面積時進行傳代。

1.3 乳腺癌荷瘤裸鼠模型的建立

人乳腺癌細胞MCF-7培養(yǎng)于細胞完全培養(yǎng)基中，取處于對數(shù)生長期的細胞，0.25%胰蛋白酶消化液消化，F(xiàn)BS終止消化后離心(1000 rpm、5 min)后去上清，加入生理鹽水重懸細胞并計數(shù)，制成單細胞懸液，并將細胞密度調(diào)整至5×107個/ml，取200 μl細胞懸液接種至裸鼠左側(cè)上肢腋下的皮下，其后每日觀察腫瘤直徑，將腫瘤直徑≥5 mm定義為造模成功。

1.4 實驗分組及給藥

將造模成功的18只裸鼠隨機分為對照組、SAMC低劑量組及SAMC高劑量組，每組6只。對照組給予生理鹽水腹腔注射；低劑量SAMC組給予150 mg/kg的SAMC腹腔注射；高劑量組給予300 mg/kg的SAMC腹腔注射。裸鼠飼養(yǎng)于無菌動物房中，每48 h給藥一次，共計給藥10次。

1.5 腫瘤直徑的測量

每隔4天測量一次腫瘤直徑，采用游標卡尺準確讀數(shù)并記錄。

1.6 Q-PCR法檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的轉(zhuǎn)錄水平

末次給藥結(jié)束48 h后，采用脫頸法處死裸鼠并取瘤，PBS清洗后加入Trizol LS裂解液提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，設(shè)計Bcl-2、Bax基因引物，對各自基因進行Q-PCR擴增并分析結(jié)果。

1.7 Western blot檢測cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax、JNK、p-JNK、p38、p-p38、p-IκBα、NF-κB p65蛋白的表達水平

末次給藥結(jié)束48 h后，采用脫頸法處死裸鼠并取瘤，PBS清洗后加入RIPA組織/細胞高效裂解液進行裂解，超聲勻漿后通過低溫高速離心機進行離心(4 ℃、12000 rpm、20 min)，小心收集上清后通過BSA法進行總蛋白濃度測定，完畢后加入Loading Buffer煮沸10 min，并置于-20 ℃冰箱中備用。經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后加入1.5%封閉用牛奶進行封閉，結(jié)束后分別加入一抗后4 ℃過夜，TBST洗膜后加入HRP標記二抗，室溫下孵育2 h，經(jīng)過TBST洗膜后通過增強化學(xué)發(fā)光法進行化學(xué)發(fā)光，并通過ImageJ軟件進行條帶灰度值分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SAMC干預(yù)對荷瘤裸鼠乳腺癌直徑的影響

SAMC干預(yù)期間，每隔4天通過游標卡尺測量荷瘤裸鼠腫瘤直徑，結(jié)果顯示：在觀察期間，各組乳腺癌瘤體直徑均增長。在相同觀察時間下，與對照組相比，低劑量SAMC組的腫瘤直徑更小(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量SAMC組的腫瘤直徑進一步減小(P<0.05)，見表1。

表1 SMAC處理后各組裸鼠瘤體直徑

2.2 SAMC干預(yù)對凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax轉(zhuǎn)錄水平的影響

荷瘤裸鼠腹腔注射給藥10次后，Q-PCR法檢測SAMC干預(yù)后對乳腺癌細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果顯示：給予SAMC干預(yù)后，與對照組相比，乳腺癌細胞中抗凋亡基因Bcl-2的轉(zhuǎn)錄水平降低，促凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.05)，與低劑量組相比，高劑量SAMC組中這一現(xiàn)象更為顯著(P<0.05)，見表2。

2.3 SAMC干預(yù)對凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax表達水平的影響

荷瘤裸鼠腹腔注射給藥10次后，Western blot法檢測SAMC干預(yù)后對乳腺癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax表達水平的影響，結(jié)果顯示：給予SAMC干預(yù)后，與對照組相比，乳腺癌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平降低，促凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase-3的表達水平升高(P<0.05)，而對Caspase-3的表達水平無顯著影響(P>0.05)與低劑量組相比，高劑量SAMC組中這一現(xiàn)象更為顯著(P<0.05)，見表3。

表2 Q-PCR法檢測SMAC處理后瘤體的Bcl-2、Bax基因轉(zhuǎn)錄水平變化

表3 SMAC處理后瘤體的Bcl-2、Bax、Caspase-3、cleaved-Caspase-3蛋白表達水平變化

2.4 SAMC干預(yù)對MAPK信號通路相關(guān)蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38表達水平的影響

荷瘤裸鼠腹腔注射給藥10次后，Western blot法檢測SAMC干預(yù)后對MAPK信號通路相關(guān)蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38表達水平的影響，結(jié)果顯示：給予SAMC干預(yù)后，與對照組相比，乳腺癌細胞中MAPK信號通路相關(guān)蛋白p-JNK、p-p38的表達水平升高(P<0.05)，而JNK、p38的表達水平無顯著差異(P>0.05)與低劑量組相比，高劑量SAMC組中這一現(xiàn)象更為顯著(P<0.05)，見表4。

表4 SMAC處理后瘤體MAPK信號通路JNK、p-JNK、p38、p-p38蛋白表達水平變化

2.5 SAMC干預(yù)對NF-κB信號通路p-IκBα、p65蛋白表達水平的影響

對荷瘤裸鼠腹腔注射給藥10次后，Western blot法檢測SAMC干預(yù)后對乳腺癌細胞中NF-κB信號通路p-IκBα、NF-κB p65蛋白表達水平的影響，結(jié)果顯示：給予SAMC干預(yù)后，與對照組相比，乳腺癌細胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白p-IκBα、p65的表達水平降低(P<0.05)，與低劑量組相比，高劑量SAMC組中這一現(xiàn)象更為顯著(P<0.05)，見表5。

表5 SMAC處理后瘤體的NF-KB信號通路p-Iκbα、p65蛋白表達水平變化

3 討論

隨著對中國傳統(tǒng)藥物研究的不斷深入，天然植物提取物的相關(guān)研究是當(dāng)前的熱點之一。大蒜素是1種從百合科植物大蒜的鱗莖中所提取出來的含硫天然混合物，主要包括二烯丙基硫化物、二烯丙基等化合物[2]。現(xiàn)有的研究表明，大蒜素具有抑制多種腫瘤細胞的增殖并且促進其凋亡的作用[4]。S-烯丙基巰基半胱氨酸(SAMC)作為大蒜素中的主要成分之一，對結(jié)腸癌、骨肉瘤以及腺樣囊性癌細胞具有明顯的抑制增殖與促凋亡作用[5]。本研究通過建立乳腺癌的荷瘤裸鼠模型，腹腔注射給予不同劑量的SAMC進行干預(yù)，觀察SAMC在體內(nèi)環(huán)境下的抗乳腺癌作用，并探討其發(fā)揮作用的可能的分子機制。本研究結(jié)果顯示，SAMC組的腫瘤直徑明顯小于對照組，說明SAMC對腫瘤生長具有明顯的抑制作用；于此同時，SAMC高劑量組的腫瘤直徑小于SAMC低劑量組，說明SAMC在作用于腫瘤時，作用效果與劑量呈正相關(guān)。

細胞增殖與凋亡之間的失衡是腫瘤發(fā)生的重要原因之一，因此，對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控是治療腫瘤的重要途徑之一[6-7]，Bcl-2與Bax之間的平衡對藥物調(diào)控腫瘤細胞凋亡水平具有重要意義[8]。Casepase-3在細胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用，Caspase-3被剪切后形成cleaved Caspase-3從而發(fā)揮導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡的功能。為了進一步研究SAMC抑制腫瘤的作用機制，我們通過Q-PCR與Western blot檢測凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax的基因轉(zhuǎn)錄水平與cleaved Caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax的蛋白表達水平。在本研究中，我們通過給予荷瘤裸鼠SAMC腹腔注射，觀察藥物干預(yù)后對裸鼠皮下乳腺癌組織中凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平與相關(guān)蛋白的表達水平，結(jié)果顯示：SAMC作用于乳腺癌荷瘤小鼠后，能夠顯著抑制腫瘤細胞中Bcl-2的基因轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達水平，并且能夠明顯促進Bax的基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達，同時能夠促進Caspase-3的活化，進而促進腫瘤細胞的凋亡，發(fā)揮抑制乳腺癌生長的作用；此外與低劑量組相比，高劑量SAMC組中Bcl-2的表達水平更低，Bax的表達水平與Caspase-3的活化水平更高，提示給予荷瘤裸鼠高劑量的SAMC能夠進一步促進乳腺癌細胞的凋亡，更好地發(fā)揮其抗腫瘤作用。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，在接受到細胞因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)等刺激后能夠被激活，從而將信號轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)[9]，其中P38通路與JNK通路與腫瘤的關(guān)系十分密切。p38通路可通過激活p53、誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位以及參與Fas/FasI介導(dǎo)的凋亡發(fā)揮促進腫瘤細胞凋亡的作用[10-14]；而JNK通路參與調(diào)控Bax、CytC、Fas/FasI、Caspase-3等凋亡相關(guān)因子，實現(xiàn)對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控[15-17]。因此，本研究試圖通過觀察SAMC作用于荷瘤裸鼠后，乳腺癌組織中MAPK信號通路相關(guān)蛋白JNK、p-JNK、p38、p-p38的表達情況，闡明SAMC促進乳腺癌細胞凋亡的分子機制。結(jié)果表明，經(jīng)過SAMC干預(yù)后，乳腺癌組織中p-JNK、p-p38的表達水平顯著升高，且高劑量SAMC組與低劑量SAMC組相比蛋白表達水平升高更為明顯，而SAMC對JNK及p38蛋白表達無明顯影響。這一結(jié)果表明，SAMC作用于荷瘤裸鼠后，通過激活MAPK信號通路中的P38與JNK通路，發(fā)揮促進乳腺癌細胞凋亡的作用。

NF-κB信號通路與炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生具有十分密切的關(guān)系[18-21]，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，SAMC作用于荷瘤裸鼠后，能夠顯著抑制IκBα的磷酸化，進而阻止NF-κB的轉(zhuǎn)錄和表達。此外，SAMC還能夠直接抑制NF-κB p65的活性，從而抑制乳腺癌細胞的基因轉(zhuǎn)錄活性，以達到抑制腫瘤細胞的目的。且與低劑量SAMC組相比，高劑量SAMC組中IκBα的磷酸化水平與NF-κB p65的表達水平更低，說明SAMC在體內(nèi)環(huán)境下對NF-κB信號通路的抑制作用具有明顯的劑量依賴性，其作用效果與SAMC劑量呈正相關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SAMC在體內(nèi)環(huán)境下能夠通過激活MAPK信號通路同時抑制NF-κB信號通路，進而促進乳腺癌荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤細胞的凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的目的，且這一作用效果與藥物劑量呈正相關(guān)。作為植物提取物大蒜素中的主要成分之一，SAMC在治療腫瘤性疾病尤其是乳腺癌方面具有非常廣闊的前景，希望能夠通過本研究，為SAMC應(yīng)用于臨床提供實驗基礎(chǔ)與理論依據(jù)。