蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵對(duì)美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒香氣的影響

祝 霞 王 詩(shī) 趙丹丹 韓舜愈 楊學(xué)山

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730070； 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730070)

0 引言

酒精度小于7%vol的低醇葡萄酒具有干型葡萄酒顏色、香氣、營(yíng)養(yǎng)成分等基本性狀，而且可有效避免酒精對(duì)人體的傷害[1-2]。相對(duì)成熟的低醇葡萄酒生產(chǎn)工藝主要包括減少可發(fā)酵糖[3]、脫醇[4]以及特種微生物發(fā)酵[5]等，這些工藝在降低酒精度的同時(shí)，不可避免地造成了葡萄酒香氣風(fēng)味損失，有時(shí)甚至還會(huì)產(chǎn)生異味[6-7]。文獻(xiàn)[8-9]的研究表明，采用產(chǎn)酒精能力較弱的非釀酒酵母與釀酒酵母菌株混菌發(fā)酵能明顯提升貴人香、美樂(lè)低醇葡萄酒的香氣品質(zhì)，在賦予酒體強(qiáng)烈花香、果香的同時(shí)，增強(qiáng)了香氣的復(fù)雜性和層次感。但混菌發(fā)酵生產(chǎn)低醇葡萄酒也存在酒體殘?zhí)呛蚅-蘋(píng)果酸含量較高、容易引起二次發(fā)酵等問(wèn)題，限制了其規(guī)?；a(chǎn)。

蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵(Malolactic fermentation，MLF)是在酒酒球菌(Oenococcusoeni，O.oeni)的主導(dǎo)下，利用蘋(píng)果酸-乳酸酶將酒體中酸澀感較強(qiáng)、易被微生物利用的L-蘋(píng)果酸降解為柔順、穩(wěn)定的L-乳酸，在提高生物穩(wěn)定性、降低酸度的同時(shí)，進(jìn)一步改善了口感，突出果香、增加了復(fù)雜性[10-13]。文獻(xiàn)[14]研究表明， MLF不僅使酒樣中的高級(jí)醇、高級(jí)酯、萜烯等化合物的種類(lèi)和含量均有增加，而且口感更柔和，提升了復(fù)雜性和層次感。文獻(xiàn)[15-16]研究顯示，MLF后酒體的總酸度和檸檬酸含量降低，pH值和乳酸含量增加，橙花醇、乙酸異戊酯、辛酸乙酯含量分別升高75%、75%、100%。文獻(xiàn)[17]將釀酒酵母與O.oeni同時(shí)接種進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵后酒樣中的揮發(fā)酸含量降低，水果香氣、黃油和奶油香氣突出，酒樣香氣濃郁、復(fù)雜。文獻(xiàn)[18]對(duì)櫻桃酒同時(shí)進(jìn)行酒精發(fā)酵和蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，酒樣顏色紅艷，入口柔順，酒體圓潤(rùn)，果香味馥郁協(xié)調(diào)。文獻(xiàn)[19-20]采用乳酸菌與酵母菌對(duì)低醇蘋(píng)果酒、梨酒進(jìn)行混合發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)低醇酒的總酸、總糖含量分別下降了約27.51%、36.06%，柔和指數(shù)明顯升高。目前，MLF對(duì)低醇葡萄酒理化和香氣品質(zhì)的影響研究很少。本文以模擬葡萄汁發(fā)酵篩選產(chǎn)香性能較好的本土O.oeni和商業(yè)酵母菌發(fā)酵接種方式為基礎(chǔ)，采用甘肅省河西走廊產(chǎn)區(qū)的釀酒葡萄主栽品種美樂(lè)為原料，通過(guò)微釀試驗(yàn)探究MLF對(duì)低醇葡萄酒品質(zhì)的影響，以期為生產(chǎn)代表產(chǎn)區(qū)風(fēng)土特色的高品質(zhì)低醇葡萄酒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄：美樂(lè)，2019年采摘于甘肅武威莫高葡萄酒業(yè)有限公司葡萄種植基地，葡萄漿果糖度(以葡萄糖計(jì))為194.75 g/L，總酸質(zhì)量濃度(以酒石酸計(jì))為6.56 g/L。

商業(yè)釀酒酵母ES488(意大利Enartis公司)；商業(yè)非釀酒酵母MP346(Mstschnikowiapulcherrima346)(法國(guó)Lallemand公司)；本土酒酒球菌菌株ZX-1，由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

香茅醇、香葉醇、芳樟醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸異戊酯、乙酸己酯等香氣化合物和內(nèi)標(biāo)物 2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó) Sigma 公司)；無(wú)水葡萄糖、纖維二糖、磷酸氫二銨、酒石酸氫鉀、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、偏重亞硫酸鈉、酵母浸粉、氫氧化鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；L-蘋(píng)果酸檢測(cè)試劑盒(愛(ài)爾蘭Megazyme公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150型生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；pHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁責(zé)任有限公司)；LDZX型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；TRACE 1310-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、ISQ型單四級(jí)桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)；50/30 μm DVB/CAR-PDMS型萃取頭(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1模擬葡萄汁配制

模擬汁配方[21]：葡萄糖200 g/L、纖維二糖0.2 g/L、磷酸氫二銨1.5 g/L、磷酸氫二鉀1.14 g/L、硫酸鎂1.23 g/L、酒石酸氫鉀2.5 g/L、L-蘋(píng)果酸3.0 g/L、檸檬酸0.2 g/L、酵母浸粉1.0 g/L。

1.3.2菌株活化

(1)本土O.oeni菌株

將冷凍保存在斜面上的O.oeni菌株于28℃培養(yǎng)箱活化2 h后，用接種環(huán)挑取2環(huán)至滅菌后的ATB培養(yǎng)基中，于28℃厭氧培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(600 nm處吸光度約1.2)，備用。

ATB培養(yǎng)基[17]：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5 g/L，番茄汁體積分?jǐn)?shù)25%，121℃滅菌20 min。

(2)非釀酒酵母菌株

稱(chēng)取非釀酒酵母活性干粉，溶于10倍體積的無(wú)菌水中，放置在28℃恒溫水浴鍋中活化15 min，再加入等體積的葡萄汁，于25℃下活化15 min。

(3)釀酒酵母菌株

將稱(chēng)取的釀酒酵母干粉用10倍體積的無(wú)菌水溶解，置于28℃下恒溫水浴活化10 min后，加入等體積的葡萄汁，在25℃水浴鍋中活化10 min。

1.3.3接種方式

本試驗(yàn)在文獻(xiàn)[8-9]混菌發(fā)酵低醇葡萄酒所采用接種方式的基礎(chǔ)上，為消除釀酒葡萄原料自身香氣對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的干擾，以模擬葡萄汁為基質(zhì)，設(shè)計(jì)5個(gè)處理組對(duì)接種方式進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選。其中，ZX-1菌株接種時(shí)按照接種量，取100 mL二次擴(kuò)培菌液，3 000 r/min離心10 min后棄去上清夜，將沉淀用等體積模擬葡萄汁洗入發(fā)酵瓶中。

A組：MP346菌粉與ZX-1同時(shí)接種；B組：先接種MP346，當(dāng)L-蘋(píng)果酸降至0.30 g/L以下時(shí)，再接種ES488菌粉；C組：MP346與ZX-1同時(shí)接種，發(fā)酵至酒精度為3.5%vol時(shí)，接種ES488；D組：先接種ZX-1，當(dāng)L-蘋(píng)果酸降到0.30 g/L以下時(shí)，接種MP346，發(fā)酵至酒精度為3.5%vol時(shí)接種ES488；E組(對(duì)照組)：先接種MP346，發(fā)酵至酒精度為3.5%vol，接種ES488。處理組中ZX-1菌株接種量體積分?jǐn)?shù)為5%，MP346菌粉、ES488菌粉分別按照推薦用量0.25、0.20 g/L接種。各處理組均發(fā)酵至酒精度為6.5%vol時(shí)，終止發(fā)酵，取樣檢測(cè)。

1.3.4混菌發(fā)酵接種工藝優(yōu)化

根據(jù)1.3.3節(jié)的研究結(jié)果，選擇最佳的接種方式，參照文獻(xiàn)[9]釀造美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒的工藝流程，進(jìn)行混菌發(fā)酵接種量的優(yōu)化。

混菌發(fā)酵低醇桃紅葡萄酒工藝流程：美樂(lè)葡萄→除梗破碎，帶皮渣浸漬(4℃，48 h；添加30 mg/L SO2、20 mg/L果膠酶)→過(guò)濾除皮渣→接種酵母與O.oeni菌株，發(fā)酵至酒精度為6.5%vol→恒溫靜置→取澄清液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾→灌裝。

1.3.5單因素試驗(yàn)

(1)O.oeni接種量

將60 L浸漬后過(guò)濾除皮渣的美樂(lè)葡萄汁分裝入15個(gè)5 L玻璃發(fā)酵瓶中，分別按接種量3%、4%、5%、6%、7%接入ZX-1菌株，同時(shí)接入MP346(0.25 g/L)，20℃恒溫發(fā)酵至酒精度為3.5%vol，再接入ES488(0.20 g/L)，發(fā)酵至酒精度為6.5%vol時(shí)終止發(fā)酵。取樣測(cè)定總酸含量、單寧含量、酒精度、揮發(fā)酸含量。每個(gè)酒樣重復(fù)3次，下同。

(2)非釀酒酵母接種量

將浸漬后過(guò)濾除皮渣的美樂(lè)葡萄汁等份分裝，分別以接種量0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/L接入MP346，同時(shí)接入5%的ZX-1，20℃發(fā)酵至酒精度為3.5%vol，再接入ES488(0.20 g/L)，酒精度為6.5%vol時(shí)終止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后取樣測(cè)定總酸含量、單寧含量、酒精度、揮發(fā)酸含量。

(3)釀酒酵母接種量

分別向分裝于發(fā)酵瓶的葡萄汁中，同時(shí)接種0.25 g/L的MP346和5%的ZX-1，20℃恒溫發(fā)酵至酒精度為3.5%vol，再分別按接菌量0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/L接種ES488，發(fā)酵結(jié)束后(酒精度為6.5%vol)分別取樣測(cè)定總酸含量、單寧含量、酒精度、揮發(fā)酸含量。

1.3.6正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇O.oeni接種量(即ZX-1接種量)、非釀酒酵母接種量(即MP346接種量)和釀酒酵母接種量(即ES488接種量)進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，以發(fā)酵結(jié)束后酒樣柔和指數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。重復(fù)測(cè)定3次。

表1 試驗(yàn)因素水平Tab.1 Factors and levels of design

1.3.7微釀試驗(yàn)

參照1.3.4節(jié)的發(fā)酵工藝，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行微釀試驗(yàn)。發(fā)酵至酒精度為6.5%vol時(shí)，分別將酒樣澄清液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾，灌裝即得低醇葡萄酒。取成品酒樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.8葡萄酒理化指標(biāo)測(cè)定

還原糖含量、總酸含量、揮發(fā)酸含量、酒精度、pH值、總酚含量、單寧含量、總硫含量、游離硫含量的測(cè)定均參照文獻(xiàn)[22]中的方法進(jìn)行。L-蘋(píng)果酸含量的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行。柔和指數(shù)測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]。試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

柔和指數(shù)計(jì)算公式為

S=A-(T+C)

(1)

式中S——酒樣柔和指數(shù)

A——酒精度，%vol

T——單寧質(zhì)量濃度，g/L

C——總酸質(zhì)量濃度，g/L

1.3.9揮發(fā)性香氣化合物的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[24]的方法，利用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(Solid phase microextraction combined with gas chromatography mass spectrometry，SPME-GC-MS)對(duì)樣品中的揮發(fā)性香氣化合物進(jìn)行定性定量分析檢測(cè)，其中SPME主要用于香氣成分的萃取，GC-MS用于香氣物質(zhì)的定性定量分析。采用保留指數(shù)(Retention index，RI)和 NIST-11、Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)及香精香料譜庫(kù)檢索比對(duì)進(jìn)行定性分析；對(duì)已有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(R2>0.995)定量，無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的化合物采用化學(xué)結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)相似、碳原子數(shù)相近的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行半定量。

1.4 感官評(píng)價(jià)

參照GB/T 15038—2006及文獻(xiàn)[9]的方法，并略作修改。各酒樣隨機(jī)編號(hào)后，分別從外觀、香氣和口感方面(表2)進(jìn)行3輪盲品。使用10分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度來(lái)量化，0～10分表示感覺(jué)強(qiáng)烈程度逐漸增大。

表2 美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Sensory evaluation criteria for Merlot low alcohol rose wine

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2016對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和制圖，使用IBM SPSS Statistics 19.0進(jìn)行主成分分析及多重比較(Duncan法，P<0.05)，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬汁發(fā)酵酒樣理化指標(biāo)分析

表3為采用不同接種方式發(fā)酵處理組的酒樣理化指標(biāo)。由表可知，各理化指標(biāo)均符合國(guó)標(biāo)GB/T 15038—2006要求。5組酒樣酒精度無(wú)顯著性差異，A、B、C、D 4個(gè)處理組的還原糖、總酸、L-蘋(píng)果酸含量顯著低于E組(對(duì)照組)(P<0.05)，pH值、揮發(fā)酸含量顯著高于E組(對(duì)照組)(P<0.05)，這說(shuō)明MLF不僅能夠轉(zhuǎn)化性質(zhì)活潑、能夠被細(xì)菌利用的L-蘋(píng)果酸，而且會(huì)消耗酒樣中的部分還原糖，降低二次發(fā)酵的風(fēng)險(xiǎn)。

表3 不同接種方式發(fā)酵酒樣基本理化指標(biāo)Tab.3 Basic physical and chemical indexes of wine samples fermented with different inoculation methods

2.2 不同接種方式對(duì)模擬汁發(fā)酵酒樣中揮發(fā)性香氣化合物的影響

不同接種方式下模擬汁發(fā)酵酒樣中的主要香氣物質(zhì)GC-MS檢測(cè)結(jié)果如圖1(圖中同種類(lèi)別香氣物質(zhì)不同字母表示不同處理組差異顯著)所示。試驗(yàn)共檢測(cè)出85種香氣化合物，其中酯類(lèi)33種、醇類(lèi)18種、酸類(lèi)15種、萜烯類(lèi)7種、醛酮類(lèi)11種以及其他類(lèi)1種。由圖1可知，A～E處理組分別檢測(cè)出66、63、75、69、69種香氣物質(zhì)，總量依次為4 830.19、5 836.61、5 732.50、5 940.60、6 750.99 μg/L。不同處理組發(fā)酵的酒樣產(chǎn)生同類(lèi)香氣物質(zhì)的種類(lèi)和含量存在差異。C和D處理組產(chǎn)生酯類(lèi)種類(lèi)最多，均有28種，并且C組的酯類(lèi)產(chǎn)量最高(質(zhì)量濃度3 229.52 μg/L)，與其他處理組之間存在顯著性差異(P<0.05)。A、C、D 3個(gè)處理組醇類(lèi)最多，分別為15、17、17種，且C組的醇類(lèi)產(chǎn)量最高(983.44 μg/L)，比對(duì)照組(E組)高出約24.00%。C組產(chǎn)生的酸類(lèi)化合物和醛酮類(lèi)化合物種類(lèi)相對(duì)較多，質(zhì)量濃度分別為2 383.18、132.53 μg/L，且含量與其他處理組之間差異較顯著(P<0.05)。萜烯類(lèi)化合物感官閾值低，香氣濃郁，是葡萄酒的特征香氣，與對(duì)照組相比，其他4個(gè)處理組均具有顯著性差異(P<0.05)。其他類(lèi)化合物檢出含量較少，處理組之間差異不大。

圖1 不同接種方式處理組的香氣物質(zhì)比較Fig.1 Comparison of aroma compounds in different inoculation treatment groups

由于試驗(yàn)檢測(cè)到的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類(lèi)繁多、含量差異較大，為綜合分析不同接種組合的產(chǎn)香特征，故對(duì)本試驗(yàn)檢出的香氣化合物中氣味活性值(Odor activity value，OAV)大于0.1的物質(zhì)進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis，PCA)[25]，并以特征值大于1進(jìn)行主成分抽提，得到PC1、PC2和PC3貢獻(xiàn)率分別為48.549%、22.861%、19.318%，3個(gè)主成分累計(jì)解釋總方差為90.728%，即這3個(gè)主成分能基本反映原數(shù)據(jù)的全部變異，并根據(jù)主成分分析結(jié)果得到圖2和圖3。由圖2可知，乙酸異戊酯(果香)、芳樟醇(玫瑰香、柑橘果香)、香葉醇(檸檬、天竺葵味)、己酸乙酯(香蕉、青蘋(píng)果味)等物質(zhì)在PC1正半軸上的得分較高，即PC1正半軸主要反映了葡萄酒中的花香、果香特征，而PC1負(fù)半軸反應(yīng)的香氣信息較少；9-癸烯酸(脂肪味)、癸酸乙酯(果香、脂肪味)、丁酸乙酯(香蕉、草莓味)、正己酸(乳酪味)等物質(zhì)在PC2正半軸上的得分較高，即PC2正半軸主要反映了果香、脂肪香的香氣特征，而化合物壬醛(蠟香、柑桔香)、辛酸(脂肪味)、正戊醇(果香、青草味)、辛酸乙酯(菠蘿、梨、果香味)等物質(zhì)在PC2負(fù)半軸上的得分較高，即代表葡萄酒中脂肪味以及淡淡的果香特征。由圖3可知，5個(gè)處理組酒樣的香氣特征可在這2個(gè)主成分所形成的二維平面上被很好地區(qū)分，其中C處理在PC1、PC2正半軸有較高得分，因而其酒樣的花香、果香特征突出；A、B、E處理組所在區(qū)域信息較少，香氣特征不突出；D處理組PC1得分較高，但PC2得分較低，即該組合酒樣香氣特征單一，香氣缺乏復(fù)雜性與層次性。綜合分析可知，C處理組酒樣香氣特征明顯優(yōu)于其他4個(gè)處理組，所產(chǎn)香氣物質(zhì)可賦予酒樣花香、果香味。因此，選擇C處理組接菌組合進(jìn)行后續(xù)微釀試驗(yàn)發(fā)酵。

圖2 香氣化合物PCA因子載荷圖Fig.2 Factor loading plot of PCA for aroma compounds

圖3 不同接種方式處理組的發(fā)酵香氣PCA分布圖Fig.3 PCA distribution of fermentation aroma in different inoculation treatment groups

2.3 單因素試驗(yàn)分析

2.3.1O.oeni接種量

揮發(fā)酸是葡萄酒中以游離狀態(tài)或以鹽的形式存在的所有乙酸系脂肪酸的總和，其中乙酸約占90%，在酒中的最佳質(zhì)量濃度為0.3～0.8 g/L，過(guò)高的揮發(fā)酸含量會(huì)產(chǎn)生腐敗味，嚴(yán)重影響感官品質(zhì)[26]。此外，酒精度、總酸含量和單寧含量之間的平衡能很好地判斷和反映酒體的協(xié)調(diào)性，而柔和指數(shù)則是利用這3個(gè)因素構(gòu)建的綜合指標(biāo)，通過(guò)將酒體的風(fēng)味變化進(jìn)行量化處理，從而更為直觀地判斷MLF對(duì)于葡萄酒香氣的整體貢獻(xiàn)[27]。如圖4(圖中不同字母表示差異顯著，下同)所示，隨著ZX-1接種量的增加，酒體柔和指數(shù)和揮發(fā)酸含量均呈升高趨勢(shì)且差異顯著(P<0.05)。當(dāng)接種量為6%時(shí)，柔和指數(shù)為1.046，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為0.83 g/L；而O.oeni接種量為7%時(shí)，柔和指數(shù)雖然最高(1.116)，但揮發(fā)酸質(zhì)量濃度高達(dá)1.07 g/L。究其原因，揮發(fā)酸的產(chǎn)生與檸檬酸代謝相關(guān)，而在MLF過(guò)程中，O.oeni通過(guò)代謝葡萄酒中的檸檬酸而產(chǎn)生乙酸[28]，因此，接種量增加后菌株的代謝活動(dòng)增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致?lián)]發(fā)酸含量升高。綜合考慮柔和指數(shù)與揮發(fā)酸質(zhì)量濃度，選擇接種量6%較佳。

圖4 接種量對(duì)葡萄酒柔和指數(shù)和揮發(fā)酸的影響Fig.4 Effect of O. oeni inoculation amounts on soft index and volatile acid of wine samples

2.3.2非釀酒酵母接種量

非釀酒酵母菌株具有獨(dú)特的代謝通路和較強(qiáng)的風(fēng)味酶活性，可以在降低酒精生成的同時(shí)增加甘油、萜烯和酯類(lèi)含量，降低乙酸含量，增加葡萄酒的結(jié)構(gòu)、香氣、本土特色及復(fù)雜感，進(jìn)而改善葡萄酒整體品質(zhì)[29]。由圖5可知，當(dāng)MP346接種量為0.30 g/L時(shí)，柔和指數(shù)達(dá)到最大值0.643，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為0.80 g/L，此時(shí)葡萄酒中的酸度、單寧含量、酒精度較平衡，葡萄酒的口感最佳。當(dāng)MP346接種量為0.35 g/L時(shí)，酒體柔和指數(shù)最低(0.335)，而MP346接種量為0.15 g/L時(shí)，揮發(fā)酸含量最高(質(zhì)量濃度0.83 g/L)，較低的柔和指數(shù)表明葡萄酒不太濃厚，酒體不夠飽滿(mǎn)，而過(guò)高的揮發(fā)酸含量，不僅掩蓋了葡萄酒的香氣，還會(huì)使葡萄酒失去平衡性[30]。綜合考慮柔和指數(shù)與揮發(fā)酸質(zhì)量濃度，選擇非釀酒酵母接種量0.30 g/L較佳。

圖5 非釀酒酵母接種量對(duì)葡萄酒柔和指數(shù)和揮發(fā)酸的影響Fig.5 Effect of non-S. cerevisiae inoculation amounts on soft index and volatile acid of wine samples

2.3.3釀酒酵母接種量

酵母接種量是影響發(fā)酵進(jìn)程的主要因素之一，接種量較少，啟酵速度慢；接種量大，啟酵速度快，但酒質(zhì)粗糙，葡萄酒品質(zhì)較差[31]。由圖6可知，隨著ES488接種量的增加，柔和指數(shù)先升高后下降。ES488接種量為0.25 g/L時(shí)，柔和指數(shù)最高(0.695)，且揮發(fā)酸含量較低(質(zhì)量濃度0.62 g/L)，發(fā)酵時(shí)間短(30 h)，當(dāng)ES488接種量為0.30 g/L時(shí)，雖然發(fā)酵時(shí)間最短(24 h)，但酒體柔和指數(shù)最低(0.298)，揮發(fā)酸含量與接種量為0.25 g/L時(shí)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，這是由于過(guò)大的接種量，導(dǎo)致酒體中的總酸含量過(guò)高，酒體柔和指數(shù)降低[32]。當(dāng)ES488接種量為0.10 g/L時(shí)，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)(48 h)，同時(shí)揮發(fā)酸含量高，柔和指數(shù)偏低。綜合考慮柔和指數(shù)與揮發(fā)酸質(zhì)量濃度，選擇釀酒酵母接種量0.25 g/L較佳。

圖6 釀酒酵母接種量對(duì)葡萄酒柔和指數(shù)和揮發(fā)酸質(zhì)量濃度的影響Fig.6 Effect of S. cerevisiae inoculation amounts on soft index and volatile acid concentration of wine sample

2.4 正交試驗(yàn)分析

由表4(表中X、Y、Z分別表示O.oeni接種量、非釀酒酵母接種量、釀酒酵母接種量的水平值)中R值可以看出，影響葡萄酒MLF的主次順序依次為X、Y、Z，即O.oeni接種量是影響美樂(lè)低醇葡萄酒MLF的最主要因素，其次為非釀酒酵母接種量，釀酒酵母接種量對(duì)美樂(lè)低醇葡萄酒MLF的影響最小。由K值可確定最優(yōu)組合為X3Y3Z2，即：ZX-1接種量7%，MP346接種量0.35 g/L，ES488接種量0.25 g/L，該組合為正交試驗(yàn)中的處理9，其柔和指數(shù)為1.229，高于其他8個(gè)處理組。由表5可知，ZX-1接種量、MP346接種量對(duì)美樂(lè)低醇葡萄酒MLF有顯著性影響(P<0.05)，而ES488接種量對(duì)葡萄酒MLF影響不顯著。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of orthogonal design

表5 正交試驗(yàn)方差分析Tab.5 Variance analysis of orthogonal test

文獻(xiàn)[33]研究發(fā)現(xiàn)采用O.oeni、非釀酒酵母和釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵時(shí)，酒樣揮發(fā)性酸度和乙醛降低了60%。在本試驗(yàn)中，當(dāng)MP346與ES488的接種量一定時(shí)，因O.oeni可以分解檸檬酸產(chǎn)生乙酸，所以隨著ZX-1接種量的增大，酒樣的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度升高至1.07 g/L，當(dāng)MP346接種量增大時(shí)，因非釀酒酵母可降低乙酸含量，增加乙酯類(lèi)等香氣物質(zhì)含量，所以本試驗(yàn)選用ZX-1接種量7%、MP346接種量0.35 g/L、ES488接種量0.25 g/L，即X3Y3Z2是3種發(fā)酵菌株的最佳接種比例。

2.5 微釀試驗(yàn)分析

2.5.1美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒基本理化指標(biāo)

由表6可知，在酒精度基本一致時(shí)，F(xiàn)組的殘?zhí)琴|(zhì)量濃度(81.63 g/L)低于H組(91.00 g/L)，說(shuō)明O.oeni會(huì)消耗部分還原糖；與H組相比，F(xiàn)組MLF后酒樣的總酸質(zhì)量濃度降低0.58 g/L，pH值升高0.3，L-蘋(píng)果酸完全降解(質(zhì)量濃度小于0.3 g/L)；揮發(fā)酸是葡萄酒健康狀況和腐敗情況的評(píng)判指標(biāo)之一[34]，微釀試驗(yàn)酒樣揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為0.51 g/L，符合國(guó)標(biāo)GB/T 15037—2006的要求；酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)、抗氧化性及失光沉淀起著關(guān)鍵作用[35]，單寧可使酒體保持一定的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和口感收斂性[36]。MLF后美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒的總酚質(zhì)量濃度降低0.01 g/L，單寧質(zhì)量濃度降低0.02 g/L。柔和指數(shù)體現(xiàn)出酒樣口感的協(xié)調(diào)性以及葡萄酒的肥碩、柔和特性[37]，MLF后酒樣的柔和指數(shù)升高0.8，說(shuō)明MLF可提高葡萄酒樣的柔和性，對(duì)美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒品質(zhì)的提升具有積極作用。因此，與對(duì)照組(H組)相比，接入O.oeni的低醇葡萄酒不僅酒體飽滿(mǎn)，平衡性好，且揮發(fā)酸含量低，酒體品質(zhì)良好。

表6 美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒理化指標(biāo)的變化Tab.6 Changes of physical and chemical indexes of Merlot low alcohol rose wine

2.5.2香氣物質(zhì)分析

對(duì)表7[38-43]和圖7進(jìn)行綜合分析可知：試驗(yàn)共檢測(cè)出110種香氣化合物(表7中僅列出部分種類(lèi))，其中酯類(lèi)42種、醇類(lèi)26種、酸類(lèi)14種、萜烯類(lèi)10種、醛酮類(lèi)13種以及其他類(lèi)5種。由圖7知，其中酯類(lèi)香氣物質(zhì)種類(lèi)最多，質(zhì)量濃度也最高(6 267.99 μg/L)，質(zhì)量濃度排在前6位的香氣物質(zhì)分別為辛酸(3 916.20 μg/L)、辛酸乙酯(2 023.05 μg/L)、己酸乙酯(1 732.93 μg/L)、乙酸異戊酯(1 261.03 μg/L)和正戊醇(1 114.70 μg/L)。F、H組分別檢出105、80種香氣物質(zhì)，其總質(zhì)量濃度分別為8 111.59、5 957.92 μg/L。O.oeni擁有廣泛的代謝途徑和多種酶，能賦予葡萄酒復(fù)雜的香氣，從而改變酒中酯類(lèi)、高級(jí)醇類(lèi)、酸類(lèi)和萜烯

類(lèi)等物質(zhì)成分的含量及平衡關(guān)系[44]。F組的酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)香氣化合物的含量與種類(lèi)均高于H組，尤其是辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己醇(表7中未列出)、辛酸的含量比H組分別高出約40.08%、152.00%、8.58%和4.44%，F(xiàn)組的萜烯類(lèi)質(zhì)量濃度高于H組。綜合分析，經(jīng)過(guò)MLF的葡萄酒樣不僅酯類(lèi)物質(zhì)尤其是具有果香、花香味的乙酯類(lèi)化合物含量增多，而且還增加了葡萄酒香氣的復(fù)雜性，使酒體香氣更加濃郁、圓潤(rùn)。即對(duì)于美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒而言，采用F組發(fā)酵方式更有利于提高香氣品質(zhì)。

表7 美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒揮發(fā)性香氣化合物Tab.7 Volatile aroma compounds of Merlot low alcohol rose wine

圖7 美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒的香氣物質(zhì)比較Fig.7 Comparison of aromacompounds in Merlot low alcohol rose wine

2.5.3感官評(píng)價(jià)分析

圖8 美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒感觀分析雷達(dá)圖Fig.8 Radar map of sensory analysis for Merlot low alcohol rose wine

圖8為美樂(lè)低醇桃紅葡萄酒感官分析雷達(dá)圖。F組與H組在色澤方面并無(wú)較大差異，但F組的花香、果香、余味長(zhǎng)短均高于H組，這是由于MLF提高了酒樣中的酯類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)化合物含量，與文獻(xiàn)[44]的研究結(jié)果相一致。從口感方面分析可知，MLF使酒樣的口感變得更加柔和圓潤(rùn)。因此，采用MLF后的F組酒樣更有利于花果香的形成，使酒體典型性更突出。

3 結(jié)論

(1)以不同MLF接種方式進(jìn)行模擬汁發(fā)酵的酒樣香氣化合物分析表明：本土酒酒球菌ZX-1與非釀酒酵母MP346同時(shí)接種，發(fā)酵至酒精度3.5%vol時(shí)再接種釀酒酵母ES488，發(fā)酵產(chǎn)生的酯類(lèi)種類(lèi)最多(28種)、含量最高(質(zhì)量濃度3 229.52 μg/L)，并且酯類(lèi)、酸類(lèi)、醛酮類(lèi)化合物含量與其他4個(gè)處理組之間存在顯著性差異(P<0.05)。

(2)微釀試驗(yàn)表明，ZX-1接種量、MP346接種量對(duì)美樂(lè)低醇葡萄酒MLF有顯著性影響(P<0.05)，在O.oeni接種量7%、非釀酒酵母接種量0.35 g/L、釀酒酵母接種量0.25 g/L的混菌發(fā)酵條件下，美樂(lè)低醇葡萄酒中的酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)化合物含量明顯升高，在賦予酒樣強(qiáng)烈果香、花香的同時(shí)還增強(qiáng)了酒體香氣的復(fù)雜性和層次感，風(fēng)格典型性突出，與感官評(píng)價(jià)結(jié)果相一致?？傮w而言，對(duì)美樂(lè)低醇葡萄酒進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵可明顯提升香氣品質(zhì)。