臍血干細胞移植對帕金森大鼠行為和炎癥因子的影響

樊志剛 王東 高麗 師瑞紅河南醫(yī)學高等?？茖W校

帕金森病是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病理特征為中腦黑質多巴胺（DA）能神經(jīng)元的大量缺失和死亡[1]，藥物治療雖有療效，但對震顫麻痹效果不好。細胞治療成為了一個新的方向，主要是將各種分化好的多巴胺能神經(jīng)原注射入紋狀體，臍血又稱胎盤血或臍帶血，含有豐富的造血干細胞和間充質干細胞[2]，但干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元發(fā)比例一直不高，體內存活時間較短，與其所處局部周圍的細胞環(huán)境有一定的關系，研究發(fā)現(xiàn)植入的細胞與宿主損傷處的細胞相互作用可導致細胞因子的表達變化，這些細胞因子或炎癥介質在功能恢復方面起著重要作用。

本次實驗將在體外培養(yǎng)的臍血間充質干細胞(Humanumbilical cord blood -derived mesenchymal stem cell HUMSCs)定向注射到帕金森大鼠腦內，觀察移植后對帕金森大鼠旋轉行為、TNF-α、IL-4的影響，為進一步明確干細胞的治療機制和提高移植效果提供更多選擇。

一、材料與方法

1.實驗動物。隨機對照動物實驗，雄性SD大鼠，220—250 g用于PD造模，實驗中對動物的處置符合動物倫理學要求。

2.主要試劑和儀器。6-羥基多巴胺、阿樸嗎啡，臍血干細胞提純分離試劑，ELISA試劑盒，倒置顯微鏡Olympus BX41。

3.PD模型的建立。用38g/L水合氯醛(380mg/kg)腹腔注射麻醉SD大鼠后，然后固定于立體定位儀上，參照《大鼠腦立體定位圖譜》，確定大鼠右側MFB和VTA兩點坐標。向每點用微量進樣器注射新鮮配置的6-OHDA溶液5μL。7天后腹腔注射阿樸嗎啡(1.2mg/kg)以誘發(fā)旋轉實驗，隨機將30只造模成功大鼠分成實驗組與對照組，每組15只。

4.干細胞的分離和培養(yǎng)：(1)選擇健康產(chǎn)婦的產(chǎn)后臍帶血液（800～160ml）。(2) 臍帶血在30min內利用臍血干細胞提純分離試劑進行分離，將分離的細胞以2×107/mL接種于20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)。取第3代的細胞用于后續(xù)實驗。

5.臍血干細胞移植。第3代干細胞調整濃度為3.0×105μL-1，進行細胞移植。以前囟為零點，定位右側紋狀體2個移植點：前囟前1.2 mm，矢狀縫右2.5mm，顱骨下5.2 mm；前囟前1.5 mm，矢狀縫右2.5mm，顱骨下7.3mm。實驗組每點注射8μLHUMSCs，對照組按上述方法和坐標，注入8μL的PBS。

6.觀察指標。

（1）行為學檢測。細胞移植后3,5,7周，每組每只大鼠腹腔注射1.2mg/kg的阿撲嗎啡，進行旋轉測試，注射后20min開始計數(shù)，并計數(shù)3min。

（2） ELISA法檢測腦內TNF-α、IL-4水平。細胞移植后3,5,7周，每組各取大鼠4只，以戊巴比妥鈉麻醉后取腦，參照周靖[3]等實驗方法使BCA蛋白定量試劑盒進行組織蛋白定量，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測TNF-α及IL-4的水平。

7.統(tǒng)計學分析采用所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，а=0.05。

二、結果

1.干細胞培養(yǎng)。倒置顯微鏡下可見，早期細胞不大且呈扁圓形，10d以后逐漸變大呈現(xiàn)桿狀(圖1)，20d(第3代)后向兩級伸出凸起為長梭形(圖2)。

圖1 臍血干細胞形態(tài)（×100）

圖2 臍血干細胞形態(tài)（×100）

2.臍血干細胞移植對大鼠行為學的影響。與對照組比較，移植后3周實驗組出現(xiàn)旋轉行為下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。移植后5周和7周，實驗組旋轉次數(shù)均出現(xiàn)明顯減少，功能行為得到好轉，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與移植前比較，移植后5周和7周，旋轉次數(shù)減少較多，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），見下表。

移植HUMSCs前后各組帕金森病大鼠旋轉次數(shù)(r/min)

3.臍血干細胞移植對大鼠腦內TNF-α水平的影響。與對照組比較，實驗組移植后3周，TNF-α水平下降不明顯(P>0.05)；實驗組移植后5周和7周，TNF-α水平明顯降低(P< 0.05)；與移植前比較，實驗組移植后5周和7周，TNF-α水平均明顯下降（P< 0.05）。見下表

干細胞移植前后各組TNF-α水平的比較（ng/L）

4.臍血干細胞移植對大鼠腦內IL-4的影響。與對照組比較，實驗組移植后3周， IL-4水平升高不明顯(P>0.05); 實驗組移植后5周和7周， IL-4水平明顯升高(P< 0.05);與移植前比較，實驗組移植后5周和7周，IL-4水平也顯著升高（P< 0.05）。見下表

干細胞移植前后各組IL-4水平的比較（ng/L）

三、討論

目前間充質干細胞和胚胎干細胞常用于基礎實驗治療PD，但胚胎干細胞取材不易，而間充質干細胞不僅取材方便，同時增值和分化能力又比較強。是干細胞治療的首選細胞。臍血間充質干細胞可誘導分化為神經(jīng)細胞和間質支持細胞，并分泌BDNF、GDNF等多種神經(jīng)營養(yǎng)因子[4]。實驗證實，猴子腦內移植臍血間充質干細胞后，發(fā)現(xiàn)其逐步向黑質內遷移并存活，且動物的運動癥狀明顯改善，協(xié)調和平衡能力也逐漸好轉[5]。本研究結果也顯示，實驗組在移植后5、7周大鼠旋轉次數(shù)較移植前均顯著下降，表明hUMSCs移植有利于PD大鼠運動功能的改善。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子構成的炎癥免疫細胞外液環(huán)境與MSCs移植效果有一定的關聯(lián)，細胞移植后與宿主細胞發(fā)生相互影響，正性或負性調節(jié)特定細胞因子水平，進一步影響移植細胞的存活、遷移和分化[6]。TNF-α為常見促炎性因子，它可以抑制中樞神經(jīng)的功能修復。IL-4為抗炎因子，可促進神經(jīng)纖維再生。本實驗結果顯示，移植后6周和9周，實驗組大鼠腦內TNF-α較對照組明顯減低,說明hUMSCs移植后可顯著抑制腫瘤壞死因子a的水平，減少炎癥反應對對功能恢復的不利影響。相對于對照組，hUMSCs移植后6周和9周，實驗組大鼠腦內IL-4水平均明顯升高，說明hUMSCs移植后, IL-4的升高促進神經(jīng)纖維再生，使大鼠旋轉行為有了明顯的改善。

有研究表明間充質干細胞是促進內源性神經(jīng)干細胞的分化；抑制神經(jīng)細胞凋亡；促進血管再生，重建突觸等方式發(fā)揮作用的[7]。帕金森氏病主要是多巴胺能神經(jīng)元受損，會在以后的實驗中檢測神經(jīng)遞質多巴胺的含量，用免疫組化證實多巴胺能神經(jīng)元的恢復等。