姜黃素調(diào)節(jié)SREBP和FAS改善非酒精性脂肪性肝病的研究

陳仲生?閻文柱

【摘要】目的 探究姜黃素對非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的作用和可能機(jī)制。方法 18只SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組和姜黃素組，每組各6只。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10 ml/kg灌胃，對照組給予等量生理鹽水灌胃。建模成功后，姜黃素組每日給予姜黃素100 mg/kg灌胃，對照組和模型組給予等量的羧甲基纖維素鈉。治療4周后，檢測大鼠血清ALT、AST、甘油三酯（TG）和總膽固醇（TC）水平，HE染色觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化，免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝組織固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）和脂肪酸合成酶（FAS）蛋白的表達(dá)情況，蛋白免疫印跡法檢測沉默調(diào)節(jié)蛋白6（Sirt6）和磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 模型組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達(dá)均高于對照組（P均< 0.05）;姜黃素組ALT、AST、TG、TC、SREBP和FAS蛋白表達(dá)均低于模型組（P均< 0.05）。模型組Sirt6、p-AMPK蛋白表達(dá)均低于對照組（P均< 0.05）;姜黃素組Sirt6、p-AMPK蛋白表達(dá)均高于模型組（P均< 0.05）。結(jié)論 姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。

【關(guān)鍵字】非酒精性脂肪性肝病;固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白;脂肪酸合成酶;姜黃素;

沉默調(diào)節(jié)蛋白6;磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶

Curcumin alleviates non-alcoholic fatty liver disease by regulating SREBP and FAS Chen Zhongsheng， Yan Wenzhu. Department of Gastroenterology， the Third Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University， Jinzhou 121000， China

Corresponding author， Yan Wenzhu

【Abstract】Objective To explore the regulatory mechanism of curcumin in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）. Methods Eighteen male SD rats were randomly divided into the control， model and curcumin treatment groups， 6 rats in each group. In the model and curcumin treatment groups， NAFLD rat models were established by gavage with high-fat and high-cholesterol diet， and an equivalent amount of normal saline was given in the control group. After the model establishment，? the rats were given with gavage with 100 mg/kg curcumin in the curcumin treatment group， and an equivalent amount of sodium carboxymethyl cellulose was given in the control and model groups. At 4 weeks after treatment， the serum levels of alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST）， triglyceride （TG） and total cholesterol （TC） were detected. Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining. The expression levels of sterol regulatory element-binding protein （SREBP） and fatty acid synthase （FAS） proteins in liver tissues were characterized by immunohistochemical staining. The expression levels of silent information regulator 6 （Sirt6） and phosphorylated adenylate-activated protein kinase （p-AMPK） proteins were measured by Western blot. Results In the model group， the expression levels of ALT， AST， TG， TC， SREBP and FAS proteins were significantly higher compared with those in the control group （all P < 0.05）. In the curcumin treatment group， the expression levels of ALT， AST， TG， TC， SREBP and FAS proteins were significantly lower compared with those in the model group （all P < 0.05）. In the model group， the expression levels of Sirt6 and p-AMPK proteins were significantly lower than those in the control group （both P < 0.05）. In the curcumin treatment group， the expression levels of Sirt6 and p-AMPK proteins were significantly higher than those in the model group （both P < 0.05）. Conclusion Curcumin can alleviate lipid deposition and hepatic injury in NALFD rats probably by up-regulating the expression levels of Sirt6 and p-AMPK.

【Key words】Non-alcoholic fatty liver disease;Sterol regulatory element-binding protein;

Fatty acid synthetase;Curcumin;Silent information regulator 6;

Phosphorylated adenylate-activated protein kinase

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是指排除長期大量飲酒和其他明確的肝臟損傷因素所引起的脂質(zhì)在肝細(xì)胞中儲積為病理改變的肝臟代謝性疾病。近年來，NAFLD逐漸成為全球最常見的慢性肝病[1]。目前關(guān)于NAFLD發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，現(xiàn)被公認(rèn)的是“二次打擊學(xué)說”。其可能的機(jī)制有氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)以及自噬與DNA 損傷等[2-4]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）和碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)合成的關(guān)鍵性基因，進(jìn)而參與調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝過程[5-6]。因此，通過尋找有效藥物抑制SREBP表達(dá)，對于改善NAFLD脂質(zhì)代謝紊亂至關(guān)重要。

姜黃素是一種多酚類物質(zhì)，從植物姜黃中提取。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具備抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗自噬、抗胰島素抵抗等作用，且對于糖尿病、COPD、動脈粥樣硬化、自身免疫性疾病的治療都有確切的效果。既往研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過調(diào)節(jié)SREBP，進(jìn)而參與肝臟脂質(zhì)代謝[7]。在NAFLD大鼠中，降脂顆?？梢酝ㄟ^下調(diào)肝X受體α和SREBP-1c的表達(dá)，調(diào)節(jié)脂肪酸代謝[8]。但是有關(guān)姜黃素對SREBP調(diào)節(jié)的分子機(jī)制尚不完全清楚。因此，本實驗研究通過構(gòu)建NAFLD型大鼠模型，探究姜黃素對SREBP的分子調(diào)控機(jī)制。

材料與方法

一、材 料

1.實驗動物

實驗選取雄性SPF級別，體質(zhì)量為180 ～ 200 g的SD大鼠共18只（購于錦州醫(yī)科大學(xué)動物中心）并通過動物倫理委員會批準(zhǔn)（批號：20190816），實驗動物飼養(yǎng)于濕度在30% ～ 70%、溫度維持在25 ℃的動物房內(nèi)并采取晝夜交替光照處理。

2.主要實驗藥品及試劑

膽固醇（萬邦實業(yè)有限公司，批號：2017 031625），姜黃素（上海瑞永生物科技有限公司）， SREBP一抗和脂肪酸合成酶（FAS）一抗抗體（武漢Proteintech），沉默調(diào)節(jié)蛋白6（Sirt6）一抗（武漢博士德公司），腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）一抗（美國Cell Signaling Technology），β-actin一抗（江蘇碧云天公司） PVDF膜（Millipore公司），SDS-PAGE凝膠（武漢博士德公司），一抗、二抗稀釋液（江蘇碧云天公司）。

3.主要實驗儀器

純水儀器（湖南湘儀公司），酶標(biāo)儀（江蘇碧云天公司），組織切片機(jī)（武漢賽默飛公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olmpus公司），凝膠電泳裝置（北京六一生物科技有限公司），顯影儀（上海西唐生物科技有限公司），脫色搖床（上海魯碩實業(yè)有限公司），高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

二、方 法

1.造模及分組

將18只實驗大鼠隨機(jī)分為3組，每組各6只，即為對照組、模型組、姜黃素組。模型組和姜黃素組予以高脂高膽固醇食物10 ml/kg灌胃，對照組給予生理鹽水10 ml/kg灌胃。其中高脂高膽固醇食物的配制為60%豬油、10%膽固醇及30%玉米面加200 ml食用水，熬制成糊狀，放入37℃恒溫箱內(nèi)，對照組給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)。3個月后隨機(jī)處死模型組和姜黃素組各1只大鼠，肝臟病理見肝脂肪細(xì)胞變性表明建模成功。姜黃素組給予姜黃素100 mg/kg按每日1次給藥;對照組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃;持續(xù)給藥4周。隔夜禁食水，次日清晨予大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，稱重、解剖并左心室采血，取部分肝臟組織浸泡于4%的多聚甲醛，經(jīng)脫水、石蠟包埋后行HE染色和免疫組織化學(xué)檢測。

2.相關(guān)指標(biāo)檢測

按照試劑盒說明書進(jìn)行大鼠血清中ALT、AST、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）含量測定。HE染色：4%的多聚甲醛固定大鼠肝臟組織，石蠟包埋后切片，之后行HE染色操作。免疫組織化學(xué)染色：①石蠟切片60℃下烘烤1 h;②脫蠟至水，二甲苯處理3次，每次5 min，無水乙醇處理3次，每次10 min，95%乙醇處理2次，每次10 min，dd H2O洗2次，每次5 min，0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次10 min;③消除過氧化物酶體，3% H2O2溶液孵育10 min，0.01 mmol/L PBS洗3次，每次5 min;④微波抗原修復(fù)，枸櫞酸鈉緩沖液（pH 6.0）250 ml置于微波爐中450 W預(yù)熱5 min，將組織放入緩沖液中，微波250 W加熱10 min，冷卻至室溫，約耗時40 min，雙蒸水洗3次，每次5 min，PBS洗3次，每次5 min;⑤封閉，利用5%的BSA封閉1 h;⑥打孔透膜，利用0.3%的Triton X-100孵育10 min;⑦一抗孵育，4℃濕盒孵育SREBP和FAS抗體過夜;⑧二抗孵育;⑨二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色、蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明;⑩中性樹膠封片和顯微鏡下觀察結(jié)果。

蛋白免疫印跡法：①組織碾磨，將處理完成的各組大鼠肝臟組織取出，采用PBS清洗后并用手術(shù)剪刀剪取少許肝臟組織放置于組織碾磨管內(nèi)，按照1∶5的比例加入組織裂解液后放置于組織碾磨儀中充分碾磨3 ～ 5 min;②離心，4℃以

12 000 rpm離心15 min，取組織上清液;③蛋白質(zhì)濃度測定，利用二辛可寧酸（BCA）法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度定量測定;④凝膠電泳，按照上樣量為40 μg

進(jìn)行蛋白凝膠電泳120 min;⑤轉(zhuǎn)膜，依據(jù)蛋白質(zhì)marker指示進(jìn)行切膠，并放置聚偏二氟乙烯（PVDF）膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜約90 min;⑥封閉，5%的脫脂牛奶封閉1 ～ 2 h;⑦孵育一抗，洗脫完成，孵育對應(yīng)的一抗過夜;⑧孵育二抗，室溫條件下，二抗孵育約2 h;⑨顯影，將孵育完成的PVDF膜使用吐溫-20的PBS洗滌2 ～ 3次，每次5 min，滴加顯影液顯影并拍照。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、姜黃素對大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與對照組相比，模型組ALT、AST、TG和TC增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均< 0.05）;與模型組相比，姜黃素組ALT、AST、TG和TC均降低（P均< 0.05）。

二、HE染色觀察大鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)變化

與對照組相比，模型組肝小葉內(nèi)彌漫性分布著空泡細(xì)胞，空泡大小不一，肝小葉結(jié)構(gòu)尚存，邊界模糊，有淋巴細(xì)胞分布于肝臟。相比于模型組，姜黃素組的肝小葉內(nèi)空泡細(xì)胞明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝臟內(nèi)的空泡細(xì)胞數(shù)量最少，見圖1。

三、免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝臟組織中的SREBP和FAS表達(dá)

SREBP和FAS的定位都位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)：與對照組相比，模型組SREBP和FAS的表達(dá)增加;與模型組相比，姜黃素組SREBP和FAS的表達(dá)減少，見圖2。

四、姜黃素對大鼠肝臟Sirt6和p-AMPK表達(dá)的影響

3組肝臟組織Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FSirt6 = 12.83，PSirt6 = 0.001;Fp-AMPK = 16.67，Pp-AMPK< 0.001），相比于對照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)降低（P均< 0.05）;與模型組相比，姜黃素組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)升高（P均< 0.05），見圖3。

討論

NAFLD是以彌漫性肝細(xì)胞脂肪病變而導(dǎo)致的一種病理性臨床病理綜合征。NAFLD是一種進(jìn)展性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝異常、炎性細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激所致肝細(xì)胞凋亡等因素是NAFLD發(fā)生和發(fā)展的主要原因[9]?，F(xiàn)有研究者提出在NAFLD的“二次打擊學(xué)說”中，初次主要是胰島素抵抗所致，胰島素抵抗主要通過促使外周脂解增加和高胰島素血癥引起肝細(xì)胞脂肪蓄積，并增加了對內(nèi)、外源性損害因子敏感性。二次打擊主要為反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物、脂肪細(xì)胞因子、腸應(yīng)激和腸道菌群內(nèi)毒素等各種損害因子誘導(dǎo)活動UCP-2、FAS配體等，進(jìn)而使得脂肪變性的肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥、壞死等一系列病理生理學(xué)改變[10-12]。

NAFLD是指中性脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)以脂滴或者脂質(zhì)囊泡的形式在胞質(zhì)中過度積累。在諸多研究中發(fā)現(xiàn)總膽固醇在NAFLD是非酒精性脂肪性肝炎形成和發(fā)展中所起的脂毒性作用尚不完全清楚。因此，通過研究NAFLD中膽固醇合成和代謝的相關(guān)基因顯得尤為重要。SREBP屬于螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈（bHLH-ZIP）結(jié)構(gòu)家族，是一種節(jié)脂質(zhì)合成的轉(zhuǎn)錄因子家族，是由SREBP 1a、SREBP 1c 、SREBP 2三種亞型構(gòu)成[13-14]。多項研究均指出SREBPS在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。近年來諸多研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素可以通過降低TG、TC改善NAFLD。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過下調(diào)節(jié)SREBP和FAS表達(dá)，減少脂質(zhì)在肝臟內(nèi)沉積，降低脂毒性對肝臟損害，進(jìn)而保護(hù)肝臟細(xì)胞，使得病情得以逆轉(zhuǎn)，從而治療NAFLD[15]。對此本研究初步研究發(fā)現(xiàn)，相比于模型組，通過姜黃素大鼠灌胃處理的NAFLD組SREBP和FAS的表達(dá)明顯下降，AST、ALT、TG和TC水平均明顯降低。上述結(jié)果表明，姜黃素可能通過調(diào)節(jié)SREBP和FAS，從而降低TG、TC等合成，改善NAFLD。那么姜黃素是通過何種分子機(jī)制調(diào)控SREBP表達(dá)？

Sirt6是Sirtuins家族成員之一，具有高度保守的NAD+依賴性的去乙?；福赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶而發(fā)揮抗心肌肥大的作用[16]。以往研究發(fā)現(xiàn)，Sirt6基因缺失是導(dǎo)致TG累積的主要因素，與脂肪性肝臟疾病密切相關(guān)[17]。在高脂喂養(yǎng)的小鼠中Sirt6的表達(dá)顯著降低，通過過表達(dá)Sirt6可以降低小鼠血液脂質(zhì)含量，減少肝臟內(nèi)脂肪的積累[18]。亦有研究證實，Sirt6可以通過增加AMP/ATP比例，活化AMPK信號通路，進(jìn)而調(diào)控SREBP蛋白表達(dá)[19]。因此，在本實驗研究中，我們通過蛋白免疫印跡法檢測大鼠肝臟組織中Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比于對照組，模型組Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)均明顯降低，給予姜黃素處理可以促進(jìn)Sirt6和p-AMPK蛋白表達(dá)，進(jìn)而改善NAFLD。綜上所述，姜黃素可以減輕大鼠NALFD的脂肪沉積和肝損傷，可能與Sirt6、p-AMPK的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。以上研究結(jié)果為姜黃素治療NAFLD提供了新的理論依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Younossi ZM， Koenig AB， Abdelatif D， Fazel Y， Henry L， Wymer M. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence， incidence， and outcomes. Hepatology，2016，64（1）：73-84.

[2] Kim SB， Kang OH， Lee YS， Han SH， Ahn YS， Cha SW， Seo YS， Kong R， Kwon DY. Hepatoprotective effect and synergism of bisdemethoycurcumin against MCD diet-induced nonalcoholic fatty liver disease in mice. PLoS One，2016，11（2）：e014 7745.

[3] Macías J， Mancebo M， Merino D， Téllez F， Montes-Ramírez ML， Pulido F， Rivero-Juárez A， Raffo M， Pérez-Pérez M， Merchante N， Cotarelo M， Pineda JA; Spanish AIDS Research Network-HEP09 Study Group. Changes in liver steatosis after switching from efavirenz to raltegravir among human immunodeficiency virus-Infected patients with nonalcoholic fatty liver disease. Clin Infect Dis，2017，65（6）：1012-1019.

[4] Sun LY， Yang YS， Qu W， Zhu ZJ， Wei L， Ye ZS， Zhang JR， Sun XY， Zeng ZG. Gut microbiota of liver transplantation recipients. Sci Rep，2017，7（1）：3762.

[5] 耿得珍， 卜亞茹， 焦波. 潛在的代謝性疾病治療靶點——固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白.中國藥學(xué)雜志， 2019， 54（15）：1205-1210.

[6] Horton JD， Goldstein JL， Brown MS. SREBPs： activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver. J Clin Invest，2002，109（9）：1125-1131.

[7] 韓曉群， 林劍國， 楊婧. 姜黃素對活化肝星狀細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平的影響及其機(jī)制. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志， 2018， 43（12）：1019-1023.

[8] 楊麗麗， 王淼， 柳濤， 宋海燕，勵冬斐，鄭培永，劉平，季光. 降脂顆粒對非酒精性脂肪性肝病大鼠肝X受體α和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c表達(dá)的影響. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報， 2011， 9（9）：998-1004.

[9] 肖陽， 侯云鶴，尹鑫，康鳳，李樹德，楊世昆，陶建平.人參皂苷Rg1干預(yù)非酒精性脂肪肝模型大鼠肝細(xì)胞的凋亡.中國組織工程研究，2019，23（3）：384-390.

[10] 張姍姍， 王來友. 非酒精性脂肪性肝病藥物治療學(xué)前沿與展望. 世界華人消化雜志，2019，27（2）：73-79.

[11] Satapathy SK， Sanyal AJ. Epidemiology and natural history of nonalcoholic fatty liver disease. Semin Liver Dis，2015，35（3）：221-235.

[12] Musso G， Cassader M， Rosina F， Gambino R. Impact of current treatments on liver disease， glucose metabolism and cardiovascular risk in non-alcoholic fatty liver disease （NAFLD）： a systematic review and meta-analysis of randomised trials. Diabetologia，2012，55（4）：885-904.

[13] Brown MS， Goldstein JL. The SREBP pathway： regulation of cholesterol metabolism by proteolysis of a membrane-bound transcription factor. Cell，1997，89（3）：331-340.

[14] Goldstein JL， Rawson RB， Brown MS. Mutant mammalian cells as tools to delineate the sterol regulatory element-binding protein pathway for feedback regulation of lipid synthesis. Arch Biochem Biophys，2002，397（2）：139-148.

[15] Engelking LJ， Cantoria MJ， Xu Y， Liang G. Developmental and extrahepatic physiological functions of SREBP pathway genes in mice. Semin Cell Dev Biol，2018，81：98-109.

[16] 黃小陽，李卓明，劉志平，劉培慶. SIRT6通過調(diào)節(jié)eNOS抑制心肌肥大的機(jī)制研究.中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版）， 2015，36（3）：338-345.

[17] Xiong X， Yu J， Fan R， Zhang C， Xu L， Sun X， Huang Y， Wang Q， Ruan HB， Qian X. NAMPT overexpression alleviates alcohol-induced hepatic steatosis in mice. PLoS One，2019，14（2）：e0212523.

[18] Kim HS， Xiao C， Wang RH， Lahusen T， Xu X， Vassilopoulos A， Vazquez-Ortiz G， Jeong WI， Park O， Ki SH， Gao B， Deng CX. Hepatic-specific disruption of SIRT6 in mice results in fatty liver formation due to enhanced glycolysis and triglyceride synthesis. Cell Metab，2010，12（3）：224-236.

[19] Kanfi Y， Peshti V， Gil R， Naiman S， Nahum L， Levin E， Kronfeld-Schor N， Cohen HY. SIRT6 protects against path-ological damage caused by diet-induced obesity. Aging Cell，2010，9（2）：162-173.

（收稿日期：2020-06-11）

（本文編輯：楊江瑜）