葛根淀粉生產(chǎn)水中葛根素的富集純化工藝優(yōu)化

徐夢(mèng)瑋 肖力 李漪錦 董新榮 劉德明 朱池明

摘要：研究了大孔吸附樹(shù)脂富集純化葛根淀粉生產(chǎn)排放水中葛根素的方法，并考察了15種型號(hào)的樹(shù)脂對(duì)葛根總異黃酮的動(dòng)態(tài)吸附容量及乙醇的洗脫效果。結(jié)果表明，HPD-300樹(shù)脂對(duì)葛根總異黃酮的動(dòng)態(tài)吸附容量可達(dá)到39.41 mg/mL，吸附后的樹(shù)脂以70%乙醇1.0 BV/h流速進(jìn)行梯度洗脫的洗脫率可達(dá)到91.42%。從3 L排放水中可回收總異黃酮樣品4.7 g，總異黃酮含量（UV比色法）可達(dá)到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可達(dá)31.80%?？偖慄S酮粗品經(jīng)5%鹽酸水解及重結(jié)晶，得到了96.37%高純度的葛根素樣品，相對(duì)總異黃酮粗品的回收率為15.91%。以上方法為從葛根淀粉生產(chǎn)排放水中富集純化葛根素的最佳優(yōu)化工藝條件。

關(guān)鍵詞：葛根;葛根素;分離純化;大孔吸附樹(shù)脂;總異黃酮

中圖分類號(hào)：R282? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）18-0107-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.18.021 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of enrichment and purification process of

puerarin in the production of pueraria starch

XU Meng-wei1a， XIAO Li1a， LI Yi-jin1a，DONG Xin-rong1a， LIU De-ming1b， ZHU Chi-ming2

（1a. College of Science， 1b. Center of Analytic Service， Hunan Agricultural University， Changsha? 410128，China;

2. Zhangjiangjie Pure Natural Agricultural Products Development Co. Ltd.， Zhangjiajie? 427200，Hunan，China）

Abstract： The method of puerarin enrichment and purification from water discharged by producing pueraria starch using macroporous resin as adsorption material was studied. The saturated capacity of dynamic adsorption （SCD） and elution rate （ER） of fifteen type of resin for total isoflavones of pueraria was investigated. The results indicated that the SCD for total isoflavones of pueraria was 39.41 mg/mL resin and the ER of resin was 91.42% eluted by 70% ethanol aqueous at 1.0 BV/h flow rate. And 4.7 g of crude isoflavones with the content of total isoflavones of 61.67% （UV spectrophotometry） and the content of puerarin of 31.80% （HPLC） could be recovered from? ? 3 L discharge water. A high purity sample which contained 96.37% puerarin was obtained by 5% HCl hydrolysis and recrystallization， and recovery of puerarin was 15.91%. This was the best process optimization for puerarin enrichment and purification from water extracted pueraria starch.

Key words： pueraria; puerarin; enrichment and purification; macroporous adsorbent resin; total isoflavones

葛根是國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用植物。葛根藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，中國(guó)藥典亦有收錄 [2]。葛根的主要活性成分為異黃酮類化合物 [3，4]。目前，從葛根中分離鑒定的異黃酮類化合物多達(dá)幾十種，主要有葛根素、大豆素、大豆苷、染料木素、芒柄花素等。葛根異黃酮具有植物雌激素、擴(kuò)張冠脈血管等作用，以及抗腫瘤、降血糖、降血脂及抗氧化等活性[5-10]。葛根素則為葛根中特有的一種異黃酮，在臨床上已被廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病、糖尿病、眼底疾病及腫瘤的治療[11-13]。

葛根淀粉在中國(guó)民間食用的歷史悠久。近年來(lái)，葛根淀粉生產(chǎn)開(kāi)始出現(xiàn)規(guī)模化的加工企業(yè)，但一般采用傳統(tǒng)的加工工藝[14，15]。在淀粉生產(chǎn)過(guò)程中存在用水量較大、葛根異黃酮隨水排放流失導(dǎo)致環(huán)境污染的問(wèn)題。本研究旨在建立葛根淀粉生產(chǎn)排放水中葛根素的富集純化工藝條件，為葛根資源的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 葛根素（批號(hào)：110752-201615）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。葛根淀粉生產(chǎn)排放水由張家界越天然農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)有限公司提供。大孔樹(shù)脂 HPD-300、HPD -400、HPD-100、HPD-700、HPD-722、HPD-826、HPD-750、HPD-500、HPD-450，購(gòu)自滄州寶恩吸附材料科技有限公司;D101、AB-8購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;LSA-40、ADS-7、LSA-21、DM-301購(gòu)自鄭州勤實(shí)科技有限公司。乙醇為食用級(jí)，甲醇為分析純，水為去離子水。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、島津LC-20AT高效液相色譜儀、ATY124萬(wàn)分之一電子天平購(gòu)自日本島津公司;TP-520A電子天平購(gòu)自湘儀天平儀器設(shè)備有限公司;TG16-WS高速離心機(jī)購(gòu)自長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)自昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52C購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHA-C恒溫振蕩器購(gòu)自常州智博瑞儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分析方法

1）總異黃酮含量測(cè)定。葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取 6.0 mg葛根素標(biāo)樣于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，將其定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容，搖勻。分別移取 0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mL儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。在250 nm下測(cè)定吸光度，以吸光度對(duì)葛根素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品分析：準(zhǔn)確稱取10 mg分離樣品于100 mL燒杯中，加適量甲醇溶解，定量轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，定容搖勻。在波長(zhǎng)250 nm下測(cè)定吸光度，計(jì)算測(cè)定溶液中總異黃酮的濃度C1，按公式（1）計(jì)算樣品中總異黃酮的含量。

[總異黃酮含量=C1×f×V×10-6m0×100%] （1）

式中，C1為待測(cè)液中總異黃酮的濃度（mg/L）;? ?f為稀釋倍數(shù);V為待測(cè)液體積（mL）;m0為鮮葛根的質(zhì)量（g）。

2）葛根素含量測(cè)定。HPLC條件：InertSustain-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相A為水;流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫條件：0～25.00 min，30%～70%B;25.00～25.10 min，70%～100% B;25.10～27.00 min，100% B;27.00～27.10 min，30% B;27.10～34.00 min，30% B。流速為0.80 mL/min。柱溫35 ℃。檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm。進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制葛根素濃度為1.747～57.576 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按色譜條件測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定：準(zhǔn)確稱取10 mg樣品于25 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻。按上述色譜條件測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品溶液中葛根素的濃度，并按公式（2）計(jì)算葛根素含量。

[葛根素含量=C2×f×V×10-6m0×100%] （2）

式中，C2為待測(cè)液中葛根素的濃度（mg/L）;f為稀釋倍數(shù);V為待測(cè)液體積（mL）;m0樣品質(zhì)量（g）。

1.2.2 葛根淀粉生產(chǎn)排放水的前處理 將葛根淀粉生產(chǎn)排放水靜置48 h，取上層清液于9 000 r/min下離心5 min，收集離心液，備用。

1.2.3 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)篩選 量取5 mL經(jīng)預(yù)處理的大孔樹(shù)脂于250 mL的錐形瓶中，加入上述預(yù)處理的水溶液100 mL，于25 ℃水浴的振搖器中以100 r/min速度振搖3 h，然后室溫靜置吸附18 h。取適量上清液測(cè)定吸光度。過(guò)濾，用適量去離子水清洗樹(shù)脂。然后將吸附葛根總異黃酮的樹(shù)脂置于錐形瓶中，加入95%的乙醇45 mL，按上述方法于恒溫振搖器中振搖1 h。過(guò)濾，收集濾液，定容至50 mL，測(cè)定吸光度并計(jì)算總異黃酮的濃度。計(jì)算樹(shù)脂的飽和吸附量及洗脫率。

對(duì)飽和吸附容量較大、洗脫率較高的6種樹(shù)脂重復(fù)篩選。洗脫時(shí)采用30%、50%、70%、95%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，其余方法同上。

[Qe=（C0-Ce）×Vm×100%]? ? ? （3）

式中，Qe為飽和吸附容量（mg/g）;C0、Ce為吸附前、平衡后溶液濃度（mg/mL）;V為溶液體積（mL）;m為樹(shù)脂的質(zhì)量（g）。

[洗脫率=Cx×Vxme×100%]? ? ? （4）

式中，Cx為洗脫液濃度（mg/mL）;Vx為洗脫液體積（mL），me為樹(shù)脂飽和吸附量（mg）。

1.2.4 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

1）大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附篩選。取30 mL預(yù)處理好的HPD-300、HPD-100、D101，分別裝入直徑2.0 cm，柱高10.0 cm的色譜柱中。然后以總異黃酮含量為0.967 5 mg/mL的預(yù)處理液連續(xù)上樣至飽和吸附（流出液的吸光度約等于上樣液的吸光度后繼續(xù)上樣約10%體積的上樣液）。然后先以2 BV的純水洗滌樹(shù)脂柱，再用6 BV的70%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。測(cè)定洗脫液吸光度，按式（3）、（4）分別計(jì)算樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)飽和吸附容量及動(dòng)態(tài)洗脫率。

2）大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附與洗脫條件。取30 mL預(yù)處理的HPD-300大孔樹(shù)脂，裝入直徑2.0 cm，柱高10.0 cm的色譜柱中?？疾焐蠘右褐锌偖慄S酮濃度、上樣流速對(duì)樹(shù)脂吸附的影響。間隔收集流出液，測(cè)定吸光度，繪制總異黃酮在樹(shù)脂上的動(dòng)態(tài)吸附曲線。

吸附總異黃酮的樹(shù)脂柱先以2 BV的去離子水洗滌，再依次用6 BV的30%、50%、70%乙醇進(jìn)行梯度洗脫?？疾煲掖俭w積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫效果的影響。測(cè)定洗脫液吸光度，按式（4）計(jì)算樹(shù)脂乙醇梯度的洗脫率，繪制總異黃酮的動(dòng)態(tài)洗脫曲線。進(jìn)一步用? ? 6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脫吸附在樹(shù)脂上的總異黃酮計(jì)算洗脫率，考察洗脫流速對(duì)樹(shù)脂上總異黃酮洗脫率的影響。

1.2.5 葛根素的純化 稱取2 g的葛根總異黃酮粗品于圓底燒瓶中，加入5% HCl溶液80 mL，加熱回流4 h。趁熱過(guò)濾，收集濾液。待濾液冷卻后，用NaCO3調(diào)節(jié)pH到4～5。以等體積的乙酸乙酯分3次萃取，收集水相。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后至原體積的1/10左右，冷卻過(guò)夜;過(guò)濾，收集固體。將固體用CH3COOH-H2O（1∶9，V/V）重結(jié)晶，過(guò)濾，得到高純度的葛根素樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)篩選

對(duì)15種大孔樹(shù)脂進(jìn)行初步篩選，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)HPD-300、HPD-100、HPD-500、D101、LSA-40、ADS-8 6種樹(shù)脂的吸附與洗脫效果進(jìn)行比較，并對(duì)吸附了葛根總異黃酮的樹(shù)脂依次以30%、50%、70%、95%的乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，其靜態(tài)吸附和解吸附的結(jié)果如表1所示。

由表1結(jié)果可知，葛根總異黃酮在2個(gè)非極性的HPD大孔樹(shù)脂上的靜態(tài)吸附效果均較好。從解吸附的結(jié)果上來(lái)看，吸附在樹(shù)脂上的葛根總異黃酮用30%、50%乙醇洗脫，解析率在76.65%～86.78%，而且HPD系列的非極性樹(shù)脂及D101的洗脫效果均很好。因此，進(jìn)一步選取HPD-300、HPD-100、D101進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與洗脫的效果比較。

2.2 大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附

2.2.1 動(dòng)態(tài)篩選 在靜態(tài)篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)3種大孔樹(shù)脂（HPD-300、HPD-100、D101）進(jìn)行動(dòng)態(tài)飽和吸附與洗脫的篩選。它們的動(dòng)態(tài)飽和吸附量及70%乙醇動(dòng)態(tài)洗脫的結(jié)果如表2所示。由表2可知，HPD-300樹(shù)脂對(duì)葛根總異黃酮的飽和吸附容量較大。從解吸附效果來(lái)看，70%乙醇對(duì)吸附在3種樹(shù)脂上的總異黃酮的洗脫率接近;從含量分析來(lái)看，HPD-100樹(shù)脂解吸所得樣品中葛根總異黃酮的含量較HPD-300稍低。因此，選用HPD-300進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.2.2 HPD-300樹(shù)脂的飽和吸附曲線 在30 mL樹(shù)脂（柱高10.0 cm）柱上，以總異黃酮濃度為0.80 mg/mL水溶液1.0、2.0 BV/h的流速上樣，HPD-300樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附曲線如圖1所示。在大孔樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附研究中，一般認(rèn)為流出液的濃度為上樣液濃度的1/10時(shí)對(duì)應(yīng)的流出液體積為該濃度下的泄露曲線的泄漏點(diǎn)[16]。樹(shù)脂HPD-300在2個(gè)流速條件下的泄露點(diǎn)時(shí)所對(duì)應(yīng)的體積分別為1 050 mL（1.0 BV/h）和500 mL（2.0 BV/h），此時(shí)樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附量分別為每毫升樹(shù)脂28.00、13.33 mg。此后，樹(shù)脂對(duì)總異黃酮的吸附速度減小，流出液中總異黃酮的量以較快的速度增加。當(dāng)流出液中總異黃酮的濃度接近上樣液濃度時(shí)停止上樣，此時(shí)樹(shù)脂在2個(gè)流速下的吸附量分別為每毫升樹(shù)脂37.15、35.34 mg。

2.3 HPD-300樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)洗脫

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總異黃酮洗脫的影響 將動(dòng)態(tài)吸附達(dá)飽和的樹(shù)脂依次用6 BV的 30%、50%、70%乙醇，以1.0 BV/h流速進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，30%的乙醇對(duì)吸附在HPD-300樹(shù)脂上的葛根總異黃酮的洗脫具有很好的效果。實(shí)際上，30%、50%及70%乙醇梯度洗脫時(shí)所得溶液中總異黃酮的總量分別為 795.9、227.0、29.4 mg，分別占洗脫總量的75.64%、21.57%、2.79%。根據(jù)總異黃酮在樹(shù)脂上的吸附總量計(jì)算，30%、50%及70%乙醇的洗脫率分別為70.42%、18.37%、2.63%。結(jié)果表明，吸附在樹(shù)脂上的總異黃酮可由50%乙醇洗脫下來(lái)，洗脫率可達(dá)到88.79%。

2.3.2 洗脫流速對(duì)樹(shù)脂上總異黃酮洗脫率的影響 進(jìn)一步用6 BV 70%乙醇以不同的流速洗脫吸附在樹(shù)脂上的總異黃酮，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，洗脫流速較慢時(shí)，用70%乙醇洗脫使用量較少時(shí)可達(dá)到較好的洗脫效果。以6 BV的70%乙醇基本可將總異黃酮洗脫下來(lái)。計(jì)算結(jié)果表明，樹(shù)脂分別以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脫時(shí)，總異黃酮的洗脫率分別可達(dá)到91.42%、82.44%、81.06%。將洗脫液減壓回收乙醇，可得到葛根總異黃酮樣品。

2.4 分離樣品的分析

2.4.1 總異黃酮 用紫外可見(jiàn)分光光度法在250 nm處測(cè)定葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，葛根素的濃度在2.4～19.2 mg/L范圍時(shí)其濃度與吸光度具有線性關(guān)系，線性方程為Y=0.016 2+59.048 96X，（R = 0.999 8，n = 5）。

將HPD-300樹(shù)脂吸附的洗脫液回收乙醇至干燥，可得到葛根總異黃酮樣品。對(duì)樣品中總異黃酮用比色法進(jìn)行分析。用6 BV 70%乙醇以1.0、1.5、2.0 BV/h流速洗脫吸附樹(shù)脂時(shí)，從HPD-300樹(shù)脂富集所得樣品的總異黃酮含量分別可達(dá)到61.67%、60.11%、56.51%。

2.4.2 葛根素 按“1.2.1”中的色譜條件，得到色譜圖如圖4A所示，葛根素濃度在1.747～57.576 mg/L范圍內(nèi)，濃度與積分面積具有良好線性關(guān)系，y =? ? 29 348.4x - 841.565，R2 = 0.999 6（n=7）。

進(jìn)一步對(duì)大孔樹(shù)脂分離所得總異黃酮樣品及酸水解純化的葛根素樣品進(jìn)行HPLC分析，分析了葛根素的含量，HPLC圖譜如圖4所示。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，葛根淀粉生產(chǎn)排放水以大孔樹(shù)脂吸附富集，再以70%乙醇1 BV/h流速洗脫所得到總異黃酮樣品中葛根素的含量為31.80%?？偖慄S酮樣品經(jīng)酸水解、重結(jié)晶等步驟純化后得到的樣品中葛根素純度達(dá)到了96.37%。

3 小結(jié)與討論

本研究以葛根淀粉生產(chǎn)企業(yè)的排放水為原料，以HPD-300大孔樹(shù)脂吸附總異黃酮，以6 BV的70%乙醇洗脫，可實(shí)現(xiàn)排放水中總異黃酮的回收。洗脫液回收乙醇、減壓干燥后即可得到固體總異黃酮樣品（3 L排放水中可回收異黃酮樣品4.7 g）。以1.0 BV流速的70%乙醇洗脫時(shí)所得樣品中總異黃酮含量（UV比色法）可達(dá)到61.67%，葛根素含量（HPLC法）可達(dá)到31.80%。進(jìn)一步經(jīng)5%鹽酸水解及重結(jié)晶，得到了純度為96.37%的葛根素樣品（葛根素樣品相對(duì)總異黃酮粗品的收率為15.91%）。

葛根為傳統(tǒng)的藥食兩用植物，其塊狀根中淀粉含量較高，對(duì)生長(zhǎng)的環(huán)境要求不高，耐貧瘠、耐干旱，適合邊遠(yuǎn)山區(qū)種植。近年來(lái)，很多地方的葛根種植與生產(chǎn)加工已經(jīng)成為貧困山區(qū)農(nóng)民脫貧致富的引擎。但是大部分葛根產(chǎn)區(qū)小型淀粉加工廠較多，在技術(shù)上僅提取和利用了葛根淀粉。這不僅造成了葛根總異黃酮的資源浪費(fèi)，而且含總異黃酮的水直接排放會(huì)對(duì)環(huán)境造成較大的影響。葛根藥用價(jià)值的主要活性成分為葛根素等異黃酮類化合物，葛根素在臨床上用于治療心腦血管等疾病。從葛根淀粉加工廠排放水中富集回收葛根總異黃酮，并進(jìn)一步經(jīng)鹽酸水解及重結(jié)晶等步驟純化得到96.37%高純度的葛根素，這一優(yōu)化后的工藝不僅綜合利用了資源，從生產(chǎn)源頭上防止了環(huán)境污染，而且還可以為葛根生產(chǎn)企業(yè)增加經(jīng)濟(jì)收益。

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