蛋氨酸灌胃制備高同型半胱氨酸血癥大鼠模型研究

代 淵，魏江平，潘 婷，秦莉霞，王曙賓，徐世軍△

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院， 成都 611137； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 成都 611137；3. 北京斯利安藥業(yè)有限公司, 北京 100176)

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, HHcy)是一種以血液中同型半胱氨酸(Homocysteine, Hcy)含量持續(xù)高于正常水平(5～15 μmol/L)為特征的疾病，它由遺傳、環(huán)境因素、生活習(xí)慣和疾病狀態(tài)等因素所致[1]。目前制備HHcy 模型的動(dòng)物種系繁多且造模方式多樣[2-3]。高濃度Hcy或蛋氨酸飲食(水)喂養(yǎng)是最常用的造模方法，但存在造模劑量不準(zhǔn)確、原料浪費(fèi)大、血清Hcy離散度大、模型不均一等不足。本研究通過參考文獻(xiàn)報(bào)道，采用同濃度蛋氨酸溶液自由飲水法平行對(duì)照，篩選在不影響脂代謝條件下制備HHcy的最適宜蛋氨酸灌胃劑量。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

21只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院、四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所；20只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 試劑與設(shè)備

L-蛋氨酸，山東西亞化學(xué)股份有限公司；甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)試劑盒，四川邁克生物科技股份有限公司；高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)試劑盒，寧波美康生物科技股份有限公司；Hcy試劑盒，金華市強(qiáng)盛生物科技有限公司；日立7180型全自動(dòng)生化分析儀，日本株式會(huì)社日立高新技術(shù)。

2 方法

2.1 分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、2%、1.5%、1%蛋氨酸灌胃組和2%、1.5%、1%蛋氨酸飲水組各3只。第4天開始造模，各組大鼠按照10 ml/kg灌胃給予相應(yīng)藥物，每日2次，空白組和飲水組均給予等體積的純凈飲用水，連續(xù)灌胃6 周。灌胃組于第4周起按20 ml/kg灌胃給藥，飲水組第5周停止添加蛋氨酸觀察1周。根據(jù)前6周篩選結(jié)果，將20只大鼠根據(jù)體質(zhì)量和血清Hcy含量隨機(jī)分成對(duì)照組和模型組進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性驗(yàn)證，每組10只，灌胃4周，給藥體積20 ml/kg。

2.2 標(biāo)本制備

造模前測(cè)定正常飲水量、飼料消耗量和血清Hcy含量1次，造模后記錄體質(zhì)量、飼料日消耗量和飲水量，每周尾靜脈取血1次檢測(cè)血清Hcy及血脂4項(xiàng)含量。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)方法同上，但只檢測(cè)血清Hcy含量，2周1次。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)2個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量、日飼料消耗量、日飲水量變化

圖1顯示，第3周以后1%灌胃組體質(zhì)量較空白組高，1.5%和2%飲水組大鼠在第2周以后均低于空白組，且2%飲水組在第4周顯著低于空白組(P<0.05)。第5周停止添加蛋氨酸后，飲水組體質(zhì)量相對(duì)增加量大于空白組和灌胃組。

圖1 各組動(dòng)物體質(zhì)量變化比較 (單位：g)注：與空白對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

表1顯示，各組大鼠的日飼料消耗量均逐漸下降，各灌胃組和1%飲水組第4、5、6 周日飼料消耗量都高于空白組，變化趨勢(shì)與體質(zhì)量基本一致。表2顯示，各組大鼠的日飲水量均逐步下降，第3周后飲水組波動(dòng)幅度較大。

表1 各組大鼠日飼料消耗量的變化比較 (g/100 g體質(zhì)量)

表2 各組大鼠日飲水量的變化比較(ml/100 g體質(zhì)量)

3.2 各組大鼠血清TC、TG、HDL和LDL含量變化

圖2顯示，與空白組比較，1%灌胃組在第3周、1%飲水組在第3、4周、1.5%飲水組在第5周和2%飲水組TC在第6周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖3顯示，僅2%飲水組大鼠血清TG明顯升高(P<0.05)，其余各組無明顯變化(P>0.05)。

圖2 血清TC含量變化(mmol/L)注：與空白對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖3 血清TG含量變化(mmol/L)

圖4顯示，與空白組比較，灌胃組與飲水組大鼠血清HDL含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)但有增加趨勢(shì)。圖5顯示，與空白組比較，除2%飲水組外(P<0.05)其余各組大鼠血清中LDL含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.3 各組大鼠蛋氨酸日攝入量和血清Hcy含量變化

圖4 血清LDL含量變化(mmol/L)注：與空白對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖5 血清LDL含量變化(mmol/L)

表3顯示，第1～4周等濃度灌胃組和飲水組蛋氨酸日攝入量相差2～4倍，灌胃組調(diào)整給藥體積后，從第5周可以看出兩者蛋氨酸日攝入量相差不大。

表3 各組大鼠蛋氨酸日攝入量(g/3只)

圖6 血清Hcy含量變化(μmol/L)注：與空白對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖6顯示，與空白組比較，灌胃組在第6周其血清Hcy比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而1.5%灌胃組在第5周比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而飲水組造模1周后血清Hcy含量起伏不定，各組內(nèi)個(gè)體差異極大。值得注意的是，1%、1.5%飲水組血清Hcy含量在第5周前均曾恢復(fù)正常，停藥1周飲水組血清Hcy水平全部恢復(fù)至正常。

圖7 大鼠血清Hcy的影響(重復(fù)性實(shí)驗(yàn))注：與空白對(duì)照組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖7顯示，在重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中與對(duì)照組比較，第2周起模型組大鼠血清Hcy差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明該法穩(wěn)定可靠、重現(xiàn)性好且個(gè)體差異小。

4 討論

本研究最初造模4周后，灌胃組大鼠血清Hcy含量未達(dá)到HHcy造模要求。由于蛋氨酸日攝入量相差2～4倍,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中灌胃組給藥體積增大1倍。灌胃組血清Hcy水平在2周內(nèi)即達(dá)到Hhcy造模，要求且1.5%灌胃組Hcy含量升高最明顯。進(jìn)一步重復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，1.5%蛋氨酸灌胃法制備HHcy模型重現(xiàn)性好且較穩(wěn)定。相對(duì)而言，雖然飲水組血清Hcy含量較高，但個(gè)體差異極大且易恢復(fù)正常，說明飲水添加法制備HHcy模型不穩(wěn)定易反彈。

同時(shí)，2%蛋氨酸灌胃和1.5%、2%飲水可抑制動(dòng)物生長(zhǎng)即有毒性作用，而1.5%蛋氨酸灌胃和1%飲水添加對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量影響不大即為適合的造模濃度。但飲水組的日飼料消耗量和飲水量低于灌胃組，且動(dòng)物個(gè)體間蛋氨酸攝入量不均一，這可能是引起血清Hcy水平反彈的重要原因，也是導(dǎo)致模型動(dòng)物個(gè)體差異較大的關(guān)鍵因素。再者,本研究中僅2%飲水組在第6周對(duì)血清TC、TG、LDL-C含量有較大影響，但這個(gè)濃度的蛋氨酸具有明顯的毒性作用；而灌胃法對(duì)大鼠血脂水平無明顯影響,但對(duì)其有增長(zhǎng)趨勢(shì)，這可能與造模時(shí)間較短有關(guān)。此外本研究發(fā)現(xiàn)，停止添加蛋氨酸1周后，飲水組血清Hcy水平均恢復(fù)至正常，這提示蛋氨酸制備HHcy大鼠模型只適用于預(yù)防性給藥研究。綜上,本研究表明 1.5%蛋氨酸灌胃是制備HHcy大鼠模型較理想的方式，具有操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、模型穩(wěn)定不反彈、個(gè)體差異小、不影響動(dòng)物生長(zhǎng)和血脂水平等優(yōu)點(diǎn)，值得推廣使用。

[1] 那開憲.高同型半胱氨酸血癥診治中的一些誤區(qū)[J].中國臨床醫(yī)生雜志,2017,45(2):18-22.

[2] 劉新芳,姜雅秋.辛伐他汀對(duì)高同型半胱氨酸血癥模型大鼠急性心肌梗死再灌注后血清ET-1、AngⅠ、AngⅡ、CRP、MPO水平的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2014,34(3):734-735.

[3] 吳樂,劉子建,黎紅華,等.普羅布考對(duì)高同型半胱氨酸血癥兔主動(dòng)脈粥樣硬化及5-脂氧酶表達(dá)的影響[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志,2015,24(1):23-26.