精子功能的生理機(jī)制及研究進(jìn)展

任枚琪，楊瀚云，史瀟

精子在男性生殖系統(tǒng)生成并獲得運(yùn)動(dòng)能力后，還需在女性生殖道中經(jīng)歷超活化、獲能、頂體反應(yīng)、精卵識(shí)別等過程才能完成受精。其中任一環(huán)節(jié)受損均可導(dǎo)致受精障礙并影響妊娠結(jié)局。啟動(dòng)及激活精子功能是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及多種信號(hào)分子和信號(hào)通路。目前，對(duì)精子功能的理解尚不充分，對(duì)其進(jìn)行深入研究能夠?yàn)榫庸δ墚惓５脑\斷及治療提供新的思路和研究方向?，F(xiàn)從精子獲能（capacitation）、頂體反應(yīng)（acrosome reaction）、受精（fertilization）等方面綜述精子功能的生理機(jī)制及研究進(jìn)展。

1 精子獲能的生理機(jī)制

獲能是精子頭部質(zhì)膜起穩(wěn)定作用的蛋白質(zhì)和膽固醇的修飾或去除的過程，涉及質(zhì)膜膽固醇外流、質(zhì)膜重組、膜內(nèi)外離子變化、蛋白酪氨酸磷酸化、細(xì)胞骨架重排等多級(jí)信號(hào)傳導(dǎo)及酶類激活反應(yīng)。超活化（hyperactivation）運(yùn)動(dòng)是精子獲能的前提，是精子進(jìn)入雌性生殖道后發(fā)生的運(yùn)動(dòng)方式的改變，具體包括尾部呈“鞭打”狀態(tài)，頭部顯現(xiàn)類似“8”字型的運(yùn)動(dòng)軌跡。超活化運(yùn)動(dòng)主要依賴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加及Na+、K+、H+的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加后亦可啟動(dòng)精子獲能。精子細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）也是獲能啟動(dòng)因子之一。Ca2+和能刺激腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）合成環(huán)磷酸腺苷（cAMP）。ROS則通過增加cAMP水平、在細(xì)胞內(nèi)啟動(dòng)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）通路兩種方式促進(jìn)獲能。另外，女性輸卵管液中的高密度脂蛋白（highdensity lipoprotein，HDL）可直接誘導(dǎo)精子質(zhì)膜表面膽固醇外流，進(jìn)而觸發(fā)多種信號(hào)通路參與促進(jìn)精子獲能。在獲能相關(guān)信號(hào)通路中，最為主要的是cAMP-蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）通路、ERK-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路以及內(nèi)源性大麻素通路。

1.1 cAMP-PKA通路 在哺乳動(dòng)物獲能的過程中，精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+、、ROS和PKA均能激活A(yù)C合成cAMP，即cAMP-PKA信號(hào)通路。有研究提示PKA通過其調(diào)節(jié)亞基與A-激酶錨定蛋白（A-kinase anchoring proteins，AKAPs）連接，而AKAPs又能將蛋白激酶、磷酸酶及其靶蛋白固定在一定的細(xì)胞區(qū)域內(nèi)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基磷酸化，簡(jiǎn)稱蛋白酪氨酸磷酸化。蛋白酪氨酸磷酸化發(fā)生于精子鞭毛的所有部位，提示精子鞭毛的酪氨酸磷酸化提高了獲能精子的運(yùn)動(dòng)能力。此外，還有研究提示缺乏PKA催化亞基（protein kinase A-Cα2，PKACα2）的小鼠精子不能完成受精[1]。因此，cAMP-PKA通路是精子獲能中非常重要的一條信號(hào)通路。

1.2 ERK-MAPK通路 精子表面的蛋白酪氨酸磷酸化還可由ERK-MAPK通路驅(qū)動(dòng)。雖然cAMPPKA和ERK-MAPK是精子獲能中的2條平行通路，但ERK-MAPK通路還受到cAMP-PKA信號(hào)通路的間接調(diào)控[2]。研究表明，多種生長(zhǎng)因子如表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）是有效的促分裂原，能夠激活精子細(xì)胞ERK通路。此外，EGF與EGF受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的結(jié)合還能參與獲能期間PKA-MAPK途徑的蛋白酪氨酸磷酸化。

1.3 內(nèi)源性大麻素通路 內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)不僅參與調(diào)控男性生殖系統(tǒng)中激素的釋放，還參與精子獲能。內(nèi)源性大麻素主要包含花生四烯酸乙醇胺（anandamide，AEA）和2-花生四烯酸甘油酯。在排卵周期中，AEA 能夠通過激活大麻素受體1（cannabinoid receptor 1，CB1）和瞬時(shí)受體電位陽離子通道亞家族V 成員1 受體（transient receptor potential cation channel subfamily V member 1，TRPV1）誘導(dǎo)牛精子的獲能[3]。AEA涉及的信號(hào)傳導(dǎo)途徑包括刺激AC激活cAMP-PKA通路、刺激MAPK激活ERK-MAPK通路、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度以及調(diào)節(jié)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）4種。

2 精子頂體反應(yīng)的生理機(jī)制

頂體反應(yīng)是精子在穿越卵丘細(xì)胞團(tuán)間隙和透明帶（zona pellucida，ZP）時(shí)頂體發(fā)生的一系列變化。精子頭部與ZP相互識(shí)別結(jié)合，誘導(dǎo)精子頂體外膜與質(zhì)膜融合，融合后頂體內(nèi)釋放的水解酶溶解ZP，幫助精子穿越ZP到達(dá)卵子表面并受精。頂體反應(yīng)大致分為3個(gè)步驟：①頂體反應(yīng)的啟動(dòng)；②頂體反應(yīng)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路；③頂體外膜與質(zhì)膜的融合。

2.1 頂體反應(yīng)的啟動(dòng) 精子頂體反應(yīng)的啟動(dòng)主要涉及頂體與ZP的相互識(shí)別。目前比較明確的識(shí)別方式主要有以下幾種：①精子膜表面的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶（galactosyltransferase，Gal T）與透明帶蛋白3（zona pellucida protein 3，ZP3）結(jié)合[4]；②活化的EGFR與ZP3結(jié)合[5]；③精子尾部的肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（secretory actin-binding protein，SABP）與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，阻斷肌動(dòng)蛋白的聚合，引發(fā)精子頂體反應(yīng)[6]。

2.2 頂體反應(yīng)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路 在頂體反應(yīng)級(jí)聯(lián)信號(hào)通路中主要涉及以下幾種分子的作用。

2.2.1 Ca2+的作用 在精子獲能后質(zhì)膜表面的Ca2+通道打開，促使質(zhì)膜外Ca2+內(nèi)流[7]。細(xì)胞內(nèi)的Ca2+可與AC結(jié)合并激發(fā)下游cAMP-被cAMP直接激活的交換蛋白（Epac）通路，即cAMP-Epac通路促使位于頂體外膜和質(zhì)膜之間的F-肌動(dòng)蛋白解聚成G-肌動(dòng)蛋白單體，促進(jìn)頂體外膜和質(zhì)膜直接接觸，誘發(fā)頂體反應(yīng)[8]。

2.2.2 G蛋白的作用 G蛋白即鳥嘌呤核苷酸調(diào)節(jié)蛋白（guanine-binding regulatory proteins，G-proteins）。精子膜上的G蛋白與ZP3相互識(shí)別后，G蛋白耦聯(lián)的磷脂酶Cβ1（phospholipase Cβ1，PLCβ1）受體可以與跨膜AC結(jié)合并激活A(yù)C[9]，AC將底物三磷酸腺苷 （adenosine triphosphate，ATP） 轉(zhuǎn)變成cAMP，cAMP作用于PKA獨(dú)特的催化亞基Calpha2，進(jìn)而激活PKA[10]。激活的PKA通過激活磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidyl-inositol-3-kinase，PI3K） 和磷脂酶D（phospholipase D，PLD）來增強(qiáng)肌動(dòng)蛋白的聚合作用，進(jìn)而保護(hù)精子免受自發(fā)性頂體反應(yīng)（spontaneous acrosome reaction）的侵害，防止自發(fā)性頂體反應(yīng)降低受精率[11]。與此同時(shí)，cAMP可激活精子特異性Na+-H+交換裝置[12]，提高細(xì)胞內(nèi)pH值，從而進(jìn)一步促進(jìn)質(zhì)膜外Ca2+內(nèi)流[13]。

2.2.3 Epac蛋白的作用 Epac由羧基末端的催化區(qū)和氨基末端的調(diào)節(jié)區(qū)組成。Epac具有cAMP結(jié)合域，在無cAMP的情況下，調(diào)節(jié)區(qū)域可通過覆蓋CDC25同源結(jié)構(gòu)域阻止底物接近催化位點(diǎn)來抑制Epac的酶活性；結(jié)合cAMP后，構(gòu)象的改變使調(diào)節(jié)區(qū)發(fā)生位置改變，暴露出催化位點(diǎn)，解除了抑制作用。暴露出的催化區(qū)可通過催化激活鼠肉瘤（rat sarcoma，Ras）蛋白超家族中Rap亞家族的GTP酶Rap1蛋白（guanosine triphosphate pase Rap1，GTPase Rap1） 和Rab亞家族中的Rab 3A蛋白（Rab 3A protein）誘導(dǎo)頂體反應(yīng)。被激活的GTPase Rap1可將鳥嘌呤二核苷酸（guanosine diphosphate，GDP）轉(zhuǎn)化為鳥嘌呤三核苷酸（guanosine triphosphate，GTP），與此同時(shí)激活Rap1蛋白下游耦聯(lián)的PLC[14]。PLC水解磷脂酰肌醇-4，5－雙磷酸（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）產(chǎn)生1，4，5-三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3），IP3可打開門控通道動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣[15]。而被激活的Rab3A則介導(dǎo)了膜融合過程。

2.2.4 PLC的作用 在頂體反應(yīng)過程中，PLC在Rap蛋白上游和下游均起作用，因?yàn)槠渚哂?種催化活性——鳥嘌呤核苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factor，GEF）活性和水解PIP2活性[16]。GEF是激活Rap的重要因子，因此PLC的GEF活性可在Rap上游發(fā)揮作用激活Rap，將胞外、胞內(nèi)信號(hào)耦聯(lián)至Rap；同時(shí)位于Rap下游的PLC又能夠水解精子質(zhì)膜上的PIP2，生成IP3、二?；视停╠iacylglycerols，DAG）。DAG可提高膜的流動(dòng)性，IP3則可通過級(jí)聯(lián)放大作用，使質(zhì)膜內(nèi)鈣釋放[17]，保證了Rap信號(hào)的正常傳遞。

2.2.5 EGF的作用 EGF表現(xiàn)出雙重作用，在精子獲能過程中其可促進(jìn)F-肌動(dòng)蛋白的形成，而在頂體反應(yīng)中，精子F-肌動(dòng)蛋白已達(dá)較高水平，此時(shí)的EGF則會(huì)促使F-肌動(dòng)蛋白分解，誘發(fā)頂體反應(yīng)[18]。

2.3 頂體外膜與質(zhì)膜的融合 頂體外膜與質(zhì)膜融合主要涉及以下幾種信號(hào)的分子作用。

2.3.1 Rab蛋白的作用 Rab蛋白是單體G蛋白R(shí)as超家族中最大的成員，定位于精子的頭部和尾部，是細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)因子[19]。大量實(shí)驗(yàn)表明Rab3A可激活位于其下游的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs），其中PTP1B作為PTPs家族的成員，可以使P-N-乙基馬來酰亞胺敏感因子 （P-N-ethylmaleimide-sensitive factor，P-NSF）脫磷酸生成NSF，NSF與可溶性NSF附著蛋白受體（soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）協(xié)同可使頂體外膜和質(zhì)膜實(shí)現(xiàn)物理連接，以完成其膜融合組裝的功能[20]。

2.3.2 SNARE蛋白的作用 SNARE蛋白是一個(gè)20～30 ku的蛋白質(zhì)家族，多固定在膜上或與膜結(jié)合。其介導(dǎo)的膜融合過程是囊泡運(yùn)輸?shù)淖詈笠徊?，也是整個(gè)膜融合過程的核心[21]。由于精子質(zhì)膜及頂體外膜具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，其頭部親水性基團(tuán)和尾部疏水性烴鏈高度穩(wěn)定，所以膜融合過程要跨越巨大的能量屏障。而當(dāng)兩層膜靠近時(shí)，NSF與可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白（soluble NSF adaptor protein，SNAP）可催化SNARE復(fù)合物的分解[22]，釋放巨大的自由能，為膜融合提供能量[23]。同時(shí)SNARE單體能夠在細(xì)胞骨架的協(xié)助下把兩層膜拉到一起，真正實(shí)現(xiàn)頂體外膜和質(zhì)膜的融合。

精子頂體反應(yīng)的生理機(jī)制如圖1所示。位于精子質(zhì)膜上的Gal T、G蛋白、EGFR等可以與卵子表面ZP3等蛋白相互結(jié)合，介導(dǎo)精子質(zhì)膜與透明帶識(shí)別，啟動(dòng)頂體反應(yīng)。同時(shí)，女性卵泡液、孕酮等也可通過誘導(dǎo)精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加誘導(dǎo)頂體反應(yīng)。精子內(nèi)Ca2+增加以及G蛋白與PLCβ1受體的耦聯(lián)激活A(yù)C，并將ATP轉(zhuǎn)變成cAMP。cAMP可通過cAMP-PKA（依賴PKA）通路和cAMP-Epac（不依賴PKA）通路啟動(dòng)級(jí)聯(lián)信號(hào)反應(yīng)。在cAMP-PKA通路中，cAMP在激活PKA的同時(shí)，還可激活Na+-H+交換裝置，提高細(xì)胞內(nèi)pH值，促進(jìn)質(zhì)膜外Ca2+內(nèi)流。在cAMP-Epac通路中，cAMP激活Epac，進(jìn)而激活Rap1和Rab3A，Rap1下游的PLC可與PKA協(xié)同，將PIP2水解為IP3、DAG，觸發(fā)頂體外膜上的Ca2+通道，促使內(nèi)鈣釋放。與此同時(shí)Rab3A下游的PTP1B可催化P-NSF脫磷酸，所生成的NSF與SNAP可將SNARE復(fù)合物水解為SNARE單體，水解過程所釋放的巨大自由能可幫助SANRE單體誘導(dǎo)頂體外膜和質(zhì)膜實(shí)現(xiàn)物理連接，完成頂體反應(yīng)。與此同時(shí)，位于精子質(zhì)膜與頂體外膜之間的SABP通過結(jié)合AP，可阻斷AP聚合，誘導(dǎo)頂體反應(yīng)發(fā)生。

3 精子受精的生理機(jī)制

受精是指成熟的精子進(jìn)入卵子內(nèi)，與卵子融合成為合子的過程。頂體反應(yīng)后卵丘細(xì)胞層被溶解，精子頭部的透明帶結(jié)合蛋白與ZP相互結(jié)合，保證精子錨定在卵子上，為進(jìn)一步溶解ZP做好準(zhǔn)備；接著精子溶解ZP進(jìn)入卵周膜間隙，精子頭部識(shí)別并結(jié)合卵子細(xì)胞膜表面的蛋白，誘導(dǎo)精卵膜融合[24]。膜融合的成功是精子將遺傳物質(zhì)輸入卵細(xì)胞的保證，也是受精過程最重要的一步。受精涉及精子和卵子表面的多種受精相關(guān)蛋白，分子機(jī)制十分復(fù)雜，具體過程尚未完全闡明。精子表面介導(dǎo)受精的分子主要有以下幾種。

圖1 頂體反應(yīng)的信號(hào)通路圖

3.1 整聯(lián)蛋白金屬蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinase，ADAM） 該家族成員多在哺乳動(dòng)物的睪丸和附睪中表達(dá)[25]。ADAM1a、ADAM2和ADAM3基因缺陷小鼠的精子與ZP的黏附結(jié)合減少，且ADAM2缺陷型精子無法與卵母細(xì)胞質(zhì)膜完成融合[26]。由α和β亞基組成的整合素（Integrin）同樣屬于整聯(lián)蛋白家族，但卻多表達(dá)于卵母細(xì)胞表面。采用抗整合素β1亞基抗體可顯著抑制ADAM2與卵細(xì)胞的結(jié)合，進(jìn)而抑制精卵細(xì)胞間的黏附及精卵融合[27]，說明ADAM與Integrin之間的結(jié)合介導(dǎo)精卵黏附和融合。

3.2 Izumo1 其是具有單個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白超家族成員。頂體反應(yīng)后Izumo1從頂體膜向精子表面擴(kuò)散并逐漸聚集于精子質(zhì)膜赤道段[28]，敲除Izumo1基因后的小鼠不育[29]。卵子表面的Juno是葉酸受體家族蛋白同源物，Bianchi等[30]以Izumo1結(jié)構(gòu)域?yàn)榻Y(jié)合探針，發(fā)現(xiàn)Izumo1結(jié)構(gòu)域與Juno的胞外域存在強(qiáng)相互作用，且敲除Juno基因的雌鼠，其卵子無法與成熟的精子結(jié)合，說明Izumo1-Juno蛋白對(duì)在受精過程中發(fā)揮了重要作用[31]。

3.3 熱休克蛋白A2 （heat shock protein A2，HSPA2）-精子頭部黏附因子（sperm adhesion molecule 1，SPAM1） 精子HSPA2是熱休克蛋白家族成員，參與蛋白復(fù)合物的折疊、運(yùn)輸和組裝[32]。研究表明HSPA2可通過協(xié)調(diào)精子頭部結(jié)構(gòu)域的重塑以及與SPAM1形成識(shí)別復(fù)合物來介導(dǎo)精卵間的識(shí)別[33]。其在成熟精子中的含量與精卵細(xì)胞結(jié)合緊密相關(guān)[34]。

3.4 精子赤道片段蛋白（sperm equatorial segment proteins，SPESPs） 其是由一種睪丸特有的減數(shù)分裂后基因所編碼的蛋白，分布于精子的赤道部分，能夠與無透明帶的卵母細(xì)胞結(jié)合。敲除小鼠SPESP1基因或使用抗SPESP1抗體，均能顯著抑制精卵膜融合[35]。

3.5 半胱氨酸分泌蛋白（cysteine-rich secretory proteins，CRISP） CRISP家族成員主要存在于附睪中，能夠通過與卵母細(xì)胞表面互補(bǔ)位點(diǎn)的相互作用參與精卵融合[36]。其中人類附睪CRISP1是一種多功能蛋白，不僅通過卵母細(xì)胞互補(bǔ)位點(diǎn)參與精卵融合，還可與ZP3特異性相互作用，參與精子與透明帶的結(jié)合[37]。大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在精卵結(jié)合過程中CRISP2可與CRISP1互相協(xié)作，以確保受精[38]。

4 結(jié)語

正常精子功能的實(shí)現(xiàn)過程十分復(fù)雜，精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加以及cAMP的合成增加是實(shí)現(xiàn)精子功能的核心環(huán)節(jié)，涉及到大量信號(hào)分子和信號(hào)通路的正確運(yùn)行。對(duì)精子功能的生理機(jī)制進(jìn)行深入研究有益于臨床精子功能異常患者的治療。未來的研究應(yīng)著重探索在體內(nèi)條件下精子與女性生殖道相互作用時(shí)精子功能的變化情況，以及可能的治療靶點(diǎn)。