腫瘤模型研究進展及應(yīng)用

陳瑩瑩 吳玉亮 綜述 程忠平 審校

隨著國內(nèi)腫瘤發(fā)病率和死亡率逐年攀升，腫瘤成為2010年以來的主要死因，是我國一個重大的公共衛(wèi)生問題［1］。由于目前的腫瘤研究模型尚未模擬體內(nèi)腫瘤，臨床前的治療研究與臨床研究結(jié)局往往存在較大差距。構(gòu)建理想的腫瘤研究模型為目前腫瘤研究領(lǐng)域的重點之一。目前，腫瘤模型包括自發(fā)瘤模型、動物誘癌模型、人源性腫瘤細(xì)胞系（patientderived tumor cell lines，PDC）、人源性腫瘤異種移植物（patient-derived tumor xenograft，PDX）、多細(xì)胞腫瘤球體模型和腫瘤類器官模型。PDC 在無限傳代的過程中，基因組不可避免地發(fā)生了改變，且基于平面培養(yǎng)體系建立起來的腫瘤平面模型缺乏原始腫瘤的結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性及腫瘤基質(zhì)間的相互作用，從而限制了細(xì)胞系作為臨床前模型的潛力［2］。PDX 的缺陷為培養(yǎng)時間長、成瘤率低、早期發(fā)生克隆選擇［3］而改變了原始腫瘤的異質(zhì)性，尚不能作為腫瘤研究的理想模型。隨著3D培養(yǎng)技術(shù)逐漸成熟，建立了腫瘤3D培養(yǎng)模型，包括腫瘤懸浮球模型和腫瘤類器官模型。這兩種模型不僅模擬了原始腫瘤的生長環(huán)境，而且很好地模擬了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用。但腫瘤懸浮球因其穿透性差、成像困難、藥物篩選時的差異性大，從而限制了其在腫瘤研究方面的應(yīng)用［4］。類器官作為最新的腫瘤研究模型，具有培養(yǎng)簡單、成瘤率高、適合高通量藥物篩選和遺傳操作等優(yōu)點，并且在最大程度上維持了原始腫瘤的結(jié)構(gòu)和異質(zhì)性，在腫瘤研究領(lǐng)域已大規(guī)模應(yīng)用［5］。隨著類器官在藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用，臨床上針對患者的個體化藥物成為現(xiàn)實，進一步推動了精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展［2］。

1 動物誘癌模型

在動物身上誘發(fā)出與人癌相類似的惡性腫瘤，稱為癌模型，其目的在于獲得與臨床相對應(yīng)的基礎(chǔ)資料。動物誘癌模型是利用致癌物在動物模型體內(nèi)誘發(fā)癌變的模型，如大腸癌、膀胱癌、口腔癌、肺癌、食管癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌和乳腺癌等［6］。王玉民等［7］使用wistar 大鼠研究了238钚誘發(fā)骨肉瘤及其劑量-效應(yīng)相關(guān)模式，建立了穩(wěn)定的骨肉瘤實驗動物模型，并從骨肉瘤組織中，分離出骨肉瘤細(xì)胞系，建立了穩(wěn)定的瘤細(xì)胞模型，組成了完善的骨肉瘤模型系統(tǒng)，提示在工業(yè)作業(yè)中向空氣排放的有毒物質(zhì)，可以導(dǎo)致骨肉瘤，威脅著人類的健康。動物癌模型的建立為環(huán)境和食物誘導(dǎo)癌癥的防治提供了重要的理論依據(jù)，并且也為癌癥的一級預(yù)防提供了方向［6］。

2 腫瘤細(xì)胞系模型

腫瘤細(xì)胞系是利用患者的腫瘤組織，在平面培養(yǎng)體系下建立起來的一種平面永生化細(xì)胞模型，具有易于構(gòu)建、培養(yǎng)周期短、存活率高，能夠進行高通量藥物篩選的優(yōu)點［5］。在20世紀(jì)70年代，有研究建立了第一個人類永生細(xì)胞系即HeLa宮頸癌細(xì)胞系。隨著細(xì)胞遺傳學(xué)、2D培養(yǎng)體系等技術(shù)的不斷完善，細(xì)胞系作為應(yīng)用最為方便、高效的腫瘤模型被廣泛應(yīng)用［8］。

隨著研究的深入，細(xì)胞系模型的缺點也逐漸顯露出來。在2D 培養(yǎng)條件下，由于缺乏腫瘤組織的免疫微環(huán)境和血管網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，細(xì)胞系模型并不能維持原始腫瘤細(xì)胞的遺傳表型和遺傳異質(zhì)性，而且不能重現(xiàn)原始腫瘤組織的形態(tài)及功能［8］。隨著腫瘤研究的深入展開，細(xì)胞系模型已逐漸不能滿足研究人員的需求，與原始腫瘤更為相似的腫瘤模型成為了腫瘤研究的必備選項。

3 腫瘤異種移植物模型

PDX 是指將患者來源的腫瘤組織直接移植（原位或異位）到免疫缺陷的動物體內(nèi)而得到的異種移植物。由于直接取腫瘤組織進行移植，腫瘤細(xì)胞及其細(xì)胞基質(zhì)可以很大程度的保留下來，所以PDX 可以較大程度上維持原始腫瘤的異質(zhì)性以及腫瘤與其周圍基質(zhì)間的相互作用，目前已用于臨床前藥物評估和生物標(biāo)志物的鑒定［9］。

早在1775年，人類便嘗試著將腫瘤組織移植到動物體內(nèi)。之后，Toolan［10］研究證明了人類的腫瘤細(xì)胞能夠在輻射過的小鼠和大鼠體內(nèi)生長。此外，當(dāng)X射線輻射過的宿主用免疫系統(tǒng)抑制因子可的松治療時，腫瘤組織的增殖能力顯著增加。隨后，Phillips等［11］使用抗淋巴細(xì)胞的血清治療宿主小鼠，尤其當(dāng)與胸腺切除聯(lián)合使用時，PDX 的存活比例會大大增加，這表明抑制免疫反應(yīng)可以提高移植效率。

此后，免疫缺陷的小鼠模型也逐漸建立，使得腫瘤組織的移植效率大大增加。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodificiency，SCID）小鼠、非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷（non-obese diabetes/severe combined immunodificiency，NOD-SCID）小鼠等免疫缺陷小鼠模型被廣泛用于腫瘤研究，使得PDX臨床前模型的研究得到了飛速發(fā)展［12］。各種惡性腫瘤的PDX臨床前模型也相繼建立，包括結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、皮膚癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌和卵巢癌［13］。然而由于移植時并不能將整個腫瘤組織移植到小鼠體內(nèi)，免疫缺陷小鼠所培養(yǎng)的腫瘤移植物可能無法捕獲原始腫瘤組織的全部遺傳特性［14］，與原始腫瘤仍具有一定的遺傳差異性。

Morgan等［5］與對原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的PDX進行突變數(shù)的檢測發(fā)現(xiàn)，僅有43%的突變被檢測到，并且在PDX早期傳代中發(fā)現(xiàn)4個原始腫瘤中不存在的突變，提示克隆選擇和突變可能發(fā)生在腫瘤組織植入小鼠的早期過程中。因此，PDX尚未完全模擬體內(nèi)腫瘤。除此之外，PDX移植成功率仍然非常有限，在不同癌癥中差異很大［15］。且PDX的周期往往較長，遺傳操作困難，造模成本往往非常高。研究者們期待成功率更高、周期更短、性價比更高、與體內(nèi)原始腫瘤更為相似的腫瘤模型（表1）。

4 腫瘤3D培養(yǎng)模型

近年來，研究者們建立了一種3D培養(yǎng)系統(tǒng)，將細(xì)胞引入一個多孔生物相容性支架中［16］，使細(xì)胞能夠脫離平面而懸浮培養(yǎng)，以3D 的方式進行生長。體外3D 培養(yǎng)體系包括頂部矩陣、矩陣嵌入、矩陣封裝、自旋器燒瓶、微型圖板、超低吸附板、懸掛滴、磁懸浮和磁性3D打印等［4］。3D培養(yǎng)模型可分為全動物和器官外植體培養(yǎng)（包括胚胎）、細(xì)胞球體、微載體培養(yǎng)和組織工程研究模型，目前用于廣泛的細(xì)胞生物學(xué)研究，包括腫瘤生物學(xué)、細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和上皮形態(tài)的發(fā)生［17］。腫瘤3D 培養(yǎng)模型的建立，使腫瘤的治療方法變得更為具體和個性化［18］。與2D 培養(yǎng)系統(tǒng)相比，3D 培養(yǎng)系統(tǒng)模擬了原始腫瘤的生長環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞可以由一種細(xì)胞或多種細(xì)胞形成腫瘤球體模型，從而更好地模擬了細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用［19］。目前，常見的腫瘤3D 模型包括多細(xì)胞腫瘤球體（multicellular tumor spheroids，MCTS）模型和腫瘤類器官（patient derived tumor organoids，PDO）模型。

4.1 多細(xì)胞腫瘤球體模型

多細(xì)胞腫瘤球體模型（multicellular tumor spheroids，MCTS）是將患者來源的組織和細(xì)胞進行物理和酶促解離，形成單細(xì)胞懸浮液，然后將獲得的單細(xì)胞懸浮液在在具有無血清培養(yǎng)基的低附著板中培養(yǎng)，形成多細(xì)胞腫瘤球體模型。該低附著板是由于覆蓋一層薄層惰性底物（瓊脂、瓊脂糖或聚甲基丙烯酸羥乙酯（hydroxyethyl methacrylate，HEMA），使得細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的黏附性降低，促進了細(xì)胞與細(xì)胞之間的聚集和緊密生長，從而形成能夠懸浮生長的多細(xì)胞腫瘤球體［20］。

MCTS被廣泛用于腫瘤細(xì)胞的代謝［21］、侵襲和轉(zhuǎn)移［22］及腫瘤相關(guān)信號通路［23］、抗癌藥物的篩選［24］等研究。雖然腫瘤球體模型作為3D培養(yǎng)模型的先驅(qū)曾被廣泛應(yīng)用，但也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。一方面，球體尺寸和均勻性一致性差，光散射差異以及抗體穿透性差，其成像困難，且用于藥物篩選/敏感實驗時差異性較大，限制了應(yīng)用；另一方面，由松散排列的細(xì)胞形成的球體處理難度高，極易碎裂［4］，操作難度高，不適合用于大規(guī)模實驗。更重要的是，腫瘤球體模型雖然空間上很大程度模擬了原始腫瘤的三維結(jié)構(gòu)，但仍缺乏腫瘤微環(huán)境與免疫系統(tǒng)的相互作用，限制了腫瘤球體模型在腫瘤研究中的應(yīng)用。因此，類器官模型研究應(yīng)運而生。

4.2 腫瘤類器官模型

類器官是指成體干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞在體外3D培養(yǎng)體系下，自組裝形成能夠反映原始組織（成體干細(xì)胞來源）或定向分化組織（胚胎干細(xì)胞來源）特性的具有3D結(jié)構(gòu)的組織類似物［25］。在特殊的培養(yǎng)條件下，腫瘤類器官模型能在一定程度上模擬腫瘤微環(huán)境，為腫瘤的體外研究提供了與體內(nèi)環(huán)境更為相似的研究平臺（圖1）。

表1 常見的腫瘤模型之間的比較

圖1 卵巢癌類器官的培養(yǎng)過程

早在2009年，有研究通過在Lgr5+干細(xì)胞的Matrigel中加入R-spondin-1、表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）和Noggin，成功建立了mini-gut類器官培養(yǎng)體系［26］。在此培養(yǎng)體系基礎(chǔ)上建立了成體干細(xì)胞來源的、能夠自我更新、增殖并分化形成后代所必需的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的小腸類器官。類器官在正常組織上的成功嘗試與應(yīng)用，使得類器官培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤研究領(lǐng)域也快速發(fā)展，如結(jié)腸、胰腺、前列腺、乳腺、胃、肺、食管、膀胱、卵巢、腎臟、肝臟等腫瘤組織［13］。這些腫瘤類器官均具有一個非常重要的特征，能夠部分或完全重現(xiàn)原始腫瘤的異質(zhì)性［27］，非常適合用于腫瘤研究。

Kopper 等［28］團隊利用不同患者的卵巢癌組織分別培養(yǎng)了卵巢癌類器官，測序結(jié)果表明不同來源的卵巢癌類器官之間存在異質(zhì)性。隨后該研究使用卵巢癌化療方案中常用的鉑/紫杉醇類和非鉑類藥物測試化療藥物對患者來源的卵巢癌類器官體的敏感性，結(jié)果表明不同患者來源的卵巢癌類器官的藥物反應(yīng)是存在明顯差異的，這與臨床治療中的個體差異相契合［28］。這提示類器官非常適用于精準(zhǔn)醫(yī)療，能夠在很大程度上解決由于個體差異而出現(xiàn)的不同患者對同一治療方案的顯著差異化問題，改善患者的預(yù)后［2］。源自患者的腫瘤類器官可用于高通量藥物篩選和藥物敏感試驗，為個體化治療提供了強有力的證據(jù)，為精準(zhǔn)醫(yī)療的進一步發(fā)展提供了依據(jù)。

類器官在腫瘤機制研究也中有著較大的價值。腫瘤的發(fā)展是一個高度動態(tài)的過程，其突變通常因腫瘤細(xì)胞快速DNA復(fù)制而累積，包括染色體不穩(wěn)定、微衛(wèi)星不穩(wěn)定以及表觀遺傳修飾的變化［2］。由于腫瘤的病因復(fù)雜、在發(fā)展的過程中受到多種因素的調(diào)控，所以應(yīng)從多角度出發(fā)，對其發(fā)生機制進行研究，尤其是分子層面，如腫瘤的基因調(diào)控與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。采用CRISPR-cas9介導(dǎo)的基因工程地在健康的人來源的結(jié)腸組織類器官上成功逐步重現(xiàn)了腺瘤-癌的發(fā)生發(fā)展過程［29-30］，在腫瘤類器官上看到了巨大的研究價值。目前，研究證實結(jié)直腸癌的發(fā)生和WNT、TGFβ、TP53、PI3K/MAPK通路的突變有關(guān)［29］。后續(xù)的研究證實，這一系列的致癌突變能有效促進結(jié)直腸癌的生長、轉(zhuǎn)移和定植［31］。

5 結(jié)語

目前，常用的腫瘤研究模型是PDC 和PDX，但因PDC 缺乏原始腫瘤的異質(zhì)性，PDX 培養(yǎng)周期長、成瘤率低，應(yīng)用存在一定的局限性。而3D 培養(yǎng)模型的建立為腫瘤研究提供了新的思路，體外3D 培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)物更能模擬原始腫瘤的生長環(huán)境和形態(tài)，然而MCTS 因穿透性差、成像困難，而限制了其發(fā)展。腫瘤類器官作為一個新興腫瘤研究模型，為腫瘤研究提供了新的平臺。因其能在一定程度上保留腫瘤異質(zhì)性，并能長期傳代和冷凍保存，而被廣泛用于腫瘤機制、精準(zhǔn)醫(yī)療等領(lǐng)域的研究。但類器官仍存在局限性，且尚不能完全模擬腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用，也缺乏脈管系統(tǒng)，與體內(nèi)腫瘤環(huán)境還有一定差距。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的逐步發(fā)展，相信腫瘤類器官能進一步發(fā)展，更大程度上模擬體內(nèi)腫瘤，成為腫瘤個體化治療的有力工具。