GYY4137對(duì)去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠的實(shí)驗(yàn)研究

王朝迅 王聰聰 賀艷菊 李秀財(cái) 谷成英 周里鋼

上海市浦東醫(yī)院 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 201399

隨著許多國(guó)家人口老齡化的不斷增加，骨質(zhì)疏松已成為一種較為常見(jiàn)的臨床診斷。骨質(zhì)疏松常見(jiàn)于絕經(jīng)后婦女，診斷通常為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)[1]。骨質(zhì)疏松最常見(jiàn)的治療方法之一是外源性激素替代療法。然而，這會(huì)增加生殖系統(tǒng)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)[1]。雙膦酸鹽長(zhǎng)期使用可導(dǎo)致頜骨壞死和長(zhǎng)骨不典型骨折[2]。重組甲狀腺激素(PTH)藥物已被證明能直接促進(jìn)骨形成，但同時(shí)刺激破骨細(xì)胞生成，增加骨吸收[3]。因此，尋找新的治療方法具有重要的臨床意義。H2S作為一種還原劑，在生理濃度上具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用[4]。血漿內(nèi)源性H2S濃度與衰老速度和氧化應(yīng)激水平呈負(fù)相關(guān)[5]。目前普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激在PMOP中起重要作用。一些研究證實(shí)外源性H2S通過(guò)ERK1/2依賴的抗氧化機(jī)制促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成和分化，成功地抑制了過(guò)氧化氫對(duì)成骨細(xì)胞株MC3T-E1的氧化損傷[6]。GYY4137是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種新型硫化氫控釋劑，它緩慢而持續(xù)地在體內(nèi)釋放H2S，極少有毒性。它能模擬內(nèi)源性H2S的形成，作為外源供體具有優(yōu)于硫化鈉的優(yōu)勢(shì)[7]。本研究探討GYY4137對(duì)去卵巢誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松大鼠模型的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和治療方案

80只6月齡雌性Sprague-Dawley大鼠[(265±15)g，上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物]，將它們飼養(yǎng)在溫度為(23±2)℃，相對(duì)濕度為(55±10)%，并且常規(guī)12 h光照循環(huán)的房間中。由指定的人喂養(yǎng)，可以自由地吃喝。在進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥模型之前使大鼠適應(yīng)環(huán)境1周。

將80只大鼠隨機(jī)分成4組，每組20只：假手術(shù)組(Sham)、卵巢切除組(OVX)、卵巢切除組用阿侖膦酸鈉治療(OVX-ALEN)和卵巢切除組用GYY4137處理(OVX-GYY)。OVX-ALEN和OVX-GYY為治療組。GYY4137購(gòu)自Santa Cruz Biotechonology(SC-224013)并用0.9%生理鹽水稀釋。阿侖膦酸鈉的商品名為A115345，用0.9%生理鹽水稀釋。在手術(shù)前將大鼠禁食過(guò)夜，自由飲水。通過(guò)腹膜內(nèi)注射320 mg/kg的劑量水合氯醛(Sangon Biotech)來(lái)麻醉所有大鼠。固定在背上，腹部消毒，腹部中間切開(kāi)了一個(gè)切口。發(fā)現(xiàn)子宮雙峰和雙側(cè)卵巢，并分離出周圍的脂肪組織。手術(shù)期間注意止血，術(shù)后用青霉素(40 000 U/只)治療大鼠3 d以避免感染。對(duì)于Sham，在分離卵巢后縫合切口。對(duì)于OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY，完全進(jìn)行卵巢切除術(shù)并縫合切口。術(shù)后OVX-ALEN組以1 mg/kg的劑量皮下給予阿侖膦酸鈉(A115345)，OVX-GYY組以100μg/kg的劑量腹腔注射GYY4137。所有大鼠的給藥頻率每2 d一次。在第2、4、8和12周結(jié)束時(shí)，隨機(jī)選擇5只大鼠，通過(guò)乙醚吸入麻醉并從腹主動(dòng)脈采集血液。分離血漿，完全取出兩股股骨，用生理鹽水飽和的紗布包裹分別標(biāo)記，并在80 ℃保存在冷凍器中。研究期間沒(méi)有意外死亡，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為12周。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：使用磷測(cè)定試劑盒(Solarbio，China)通過(guò)磷鉬酸UV比色法測(cè)定血磷水平。用分光光度計(jì)(ThermoFisher，USA)測(cè)量磷酸鹽吸光度和濃度。使用羅氏自動(dòng)生化分析儀(cobas 8000 c702)通過(guò)比色法測(cè)定血鈣水平。使用羅氏堿性磷酸酶試劑盒，采用速度法測(cè)量ALP水平。分別使用羅氏骨鈣素或降鈣素試劑盒，采用化學(xué)發(fā)光測(cè)定OCN和降鈣素的水平。使用羅氏甲狀旁腺激素檢測(cè)試劑盒和羅氏自動(dòng)生化分析儀，采用電化學(xué)發(fā)光測(cè)量對(duì)甲苯噠啉的水平。使用Huamei Rat Leptin LEP ELISA試劑盒，采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)測(cè)定瘦素的水平。改進(jìn)的亞甲藍(lán)法用于測(cè)定血漿中的H2S水平。

1.2.2骨密度和生物力學(xué)檢測(cè)：骨密度的測(cè)定使用Hologic Double Energy X Ray 4 500 W骨密度計(jì)系統(tǒng)(DEXA)測(cè)量腰4～5椎體骨密度。大鼠股骨生物力學(xué)改變使用ElectroForce 3200 Series II測(cè)試儀器(BOSE)采用三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)量股骨骨折期間的最大應(yīng)力。

1.2.3組織學(xué)檢測(cè)：左股骨使用蘇木精伊紅染色觀察，在4%多聚甲醛中固定后，將每個(gè)股骨樣品脫鈣，在乙醇中以遞增濃度脫水，在二甲苯中洗滌并植入組織石蠟中。最后，使用5 μm切片進(jìn)行H&E染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 22.0軟件進(jìn)行?；诜讲罱Y(jié)果的同質(zhì)性檢驗(yàn)，使用Student'st檢驗(yàn)比較兩個(gè)不同組間差異。以P<0.05判斷差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠骨量的改變

OVX組顯示出明顯的骨小梁的減少，Sham組、OVX-ALEN組和OVX-GYY組的骨小梁較OVX組明顯增加，無(wú)明顯骨量減少(圖1)。

圖1 治療12周時(shí)大鼠股骨H&E染色切片(×40)Fig.1 HE staining of the femur in rats after 12 weeks of the treatment (×40)

2.2 血清指標(biāo)的改變

與假手術(shù)組比，OVX和OVX-ALEN組的H2S水平顯著下降，但OVX-GYY組的水平?jīng)]有顯著差異(圖2)。與Sham組相比，OVX組的ALP水平在第4周顯著下降(P<0.05)。8周后，OVX-GYY組的ALP水平顯著增加，但未能恢復(fù)至2周水平(P<0.05)。 12周后，OVX、OVX-ALEN和OVX-GYY組的ALP水平顯著增加(P<0.05)。然而，ALEN治療顯著降低了第8周的OCN水平(P<0.05)，而12周后的ONC水平顯著高于經(jīng)過(guò)OVX手術(shù)的組(P<0.05)。與假組相比，在第4、8和12周后，PTH水平在經(jīng)歷過(guò)OVX手術(shù)的組中增加(P<0.05)。同樣，OVX組的瘦素水平在第4、8和12周上升(P<0.05)。卵巢切除術(shù)后，降鈣素水平隨時(shí)間降低(圖2)。

圖2 GYY4137對(duì)卵巢切除大鼠血漿中硫化氫、鈣、磷和骨代謝量的影響。在4組大鼠中評(píng)估堿性磷酸酶(A)、骨鈣素(B)、降鈣素(C)、PTH(D)、瘦素(E)、硫化氫(F)、鈣(G)和磷(H)的水平。與Sham組相比，*P<0.05；與Sham組相比，**P<0.01；與OVX組相比，#P<0.05；與OVX相比，##P<0.01Fig.2 Effect of GYY4137 on hydrogen sulfide, plasma calcium, phosphorus and bone metabolism in ovariectomized rats. Levels of alkaline phosphatase(A), osteocalcin(B), calcitonin(C), PTH(D), leptin(E), hydrogen sulfide(F), calcium(G) and phosphorus(H) were evaluated in all four groups of rats. *P<0.05 compared to the Sham group; **P<0.01 compared to the Sham group; #P<0.05 compared to the OVX group; ##P<0.01 compared to OVX.

2.3 骨密度和生物力學(xué)改變

與Sham組相比，OVX組中股骨的BMD在第8、12周下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 GYY4137治療緩解了12周內(nèi)BMD的下降(P<0.05)，治療效果優(yōu)于OVX-ALEN組(圖3)。 GYY4137改善了卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松癥的最大骨應(yīng)力。通過(guò)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)測(cè)試了股骨骨折的最大應(yīng)力(圖3)。結(jié)果顯示，12周后，OVX組的最大應(yīng)力降低。OVX組骨質(zhì)疏松癥建模以與骨質(zhì)疏松癥的影響一致的方式改變股骨的最大生物力學(xué)負(fù)荷。與Sham組相比，用阿侖膦酸鹽或GYY4137治療的大鼠在最大生物力學(xué)負(fù)荷方面沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。 OVX-ALEN和OVX-GYY組也未顯示出顯著差異(P>0.05，圖3)。

圖3 股骨骨密度和強(qiáng)度試驗(yàn)結(jié)果。BMD測(cè)量值用于第8周的股骨骨密度(A)，股骨BMD在第12周(B)，OVX模型在第8周(C)，OVX模型在第12周(D)Fig.3 The results of the bone mineral density and strength test for the femur. The BMD measurements of the femur were performed on week 8 (A) or week 12 (B) in Sham rats, and on week 8(C) or week 12(D) in the OVX rats.

3 討論

作為內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，H2S是一個(gè)熱門的研究課題。多次研究證實(shí)了其在許多組織系統(tǒng)的生理和病理過(guò)程中的重要作用，包括內(nèi)臟、心血管、骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)。例如，它可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血性疾病[8]。內(nèi)源性H2S的減少可加速動(dòng)脈粥樣硬化[9]。它還可以削弱對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)氧化應(yīng)激的保護(hù)作用[10]。雌激素促進(jìn)骨形成，主要由成骨細(xì)胞上的ER受體介導(dǎo)；還通過(guò)其ER受體誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞凋亡抑制骨吸收；而骨代謝依賴于成熟和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收的平衡[11]。

血漿中的鈣和磷水平與骨骼中的水平保持動(dòng)態(tài)平衡，血漿水平反映骨組織的代謝和小腸與腎臟對(duì)鈣和磷的吸收重吸收率。在這項(xiàng)研究中，筆者研究了雌激素缺乏對(duì)大鼠血漿中H2S、鈣和磷酸鹽水平，骨骼宏觀力學(xué)和物理學(xué)以及相關(guān)激素分泌的影響。研究了GYY4137和阿侖膦酸鈉如何影響這些參數(shù)。在生物力學(xué)和生化指標(biāo)方面，OVX-GYY組與Sham組相比沒(méi)有顯著差異。外源性GYY被證明可以提高大鼠血漿中的H2S水平，并改善由于去卵巢而導(dǎo)致的鈣和磷酸鹽的不平衡。H&E染色和顯微鏡觀察也證明，在GYY干預(yù)下，OVX-GYY組的骨小梁結(jié)構(gòu)和數(shù)量與假手術(shù)組或OVX-ALEN組的結(jié)果無(wú)顯著差異。除直接作用于骨代謝外，雌激素可以增加降鈣素的分泌，抑制甲狀旁腺素的分泌，促進(jìn)腎臟中維生素D的活化，并通過(guò)鈣調(diào)節(jié)激素增加小腸中的鈣吸收。

降鈣素是甲狀腺C細(xì)胞分泌的一種多肽激素。它作用于降鈣素受體，抑制破骨細(xì)胞的活化，刺激成骨細(xì)胞的增殖，并防止細(xì)胞凋亡[12]。降鈣素還可間接抑制甲狀旁腺和維生素D的活化，降低血液中鈣的含量。其水平與年齡無(wú)關(guān)，因此降鈣素和代謝率的基本上對(duì)于骨質(zhì)疏松癥患者沒(méi)有顯著變化，這與本研究結(jié)果一致。甲狀旁腺以脈沖方式分泌甲狀旁腺素，作用于成骨細(xì)胞的甲狀旁腺素受體以增強(qiáng)骨形成。甲狀旁腺素的異常分泌，如由甲狀旁腺功能亢進(jìn)引起的持續(xù)豐富的分泌，可以增加破骨細(xì)胞的活性，導(dǎo)致骨吸收和骨質(zhì)疏松癥。本研究表明，甲狀旁腺素水平隨著時(shí)間的推移而降低，這可能與血漿中雌激素的減少有關(guān)。在OVX-ALEN組中，阿侖膦酸鈉調(diào)節(jié)降鈣素和甲狀旁腺素。然而，GYY對(duì)OVX-GYY組中的這兩種激素沒(méi)有顯著的調(diào)節(jié)作用。

瘦素是一種由白色脂肪組織分泌的全身激素，與骨代謝有更復(fù)雜的調(diào)節(jié)關(guān)系。通常認(rèn)為它作用于下丘腦長(zhǎng)受體以通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌軸調(diào)節(jié)骨代謝[13]。它還可以通過(guò)骨組織周圍的短受體直接調(diào)節(jié)骨代謝。本研究觀察到H2S可能有助于調(diào)節(jié)瘦素水平。血漿中大約50%的ALP來(lái)自成骨細(xì)胞[14]。OCN是由成骨細(xì)胞直接分泌和表達(dá)的活性多肽，它們都反映了成骨細(xì)胞的活性和狀態(tài)，代表了骨形成和重建[14]。有趣的是，阿侖膦酸鈉和GYY4137均未對(duì)OVX組中的ALP或OCN產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用，這需要進(jìn)一步研究。

一些研究表明，由間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的H2S可以調(diào)節(jié)骨骼分化，并且H2S的減少可以減少鈣通道的硫化，從而影響Ca2+通路的內(nèi)部流動(dòng)；這會(huì)減少間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化[15]。在一些實(shí)驗(yàn)中，還觀察到H2S介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化[16]。這些陳述與本研究的結(jié)果一致，表明H2S對(duì)骨代謝的益處及其改善骨質(zhì)結(jié)構(gòu)的潛力。外源性H2S可以介入和調(diào)節(jié)卵巢切除大鼠的骨質(zhì)疏松癥。在某些情況下，它甚至可以治愈由卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松癥[17]。

總之，卵巢切除的大鼠在本研究中用作受試者，以探索血漿中內(nèi)源性H2S水平與骨質(zhì)疏松癥之間的關(guān)聯(lián)。通過(guò)腹腔注射GYY4137作為內(nèi)源性H2S的補(bǔ)充，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)提高和維持血漿中H2S的生理水平可以調(diào)節(jié)鈣和磷的代謝平衡，且骨代謝的常見(jiàn)臨床指標(biāo)的影響如OCN、鈣調(diào)素、堿性磷酸酶、甲狀旁腺素和瘦素。研究結(jié)果表明，GYY4137是一種比阿侖膦酸鈉更好的干預(yù)措施，對(duì)卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松癥有一定的治療作用。