基于網(wǎng)絡藥理學探討獨活-桑寄生治療骨質(zhì)疏松癥的活性成分及生物學基礎

周帥琪 梁龍 于杰 魏戌 馮敏山 王尚全 銀河 尹遜路 陳明* 朱立國*

1.中國中醫(yī)科學院望京醫(yī)院，北京 100102 2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029 3.中醫(yī)正骨技術北京市重點實驗室，北京 100700

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是骨的脆性因骨密度降低、骨微觀結(jié)構(gòu)退化而增加的多發(fā)于中老年人的全身性骨代謝疾病，其嚴重后果為日?；顒又泄钦畚ｋU性增高，導致骨質(zhì)疏松性骨折[1]。臨床表現(xiàn)以腰酸膝軟、疼痛或全身骨痛為主。OP發(fā)病受年齡、性別、體質(zhì)、營養(yǎng)、運動等多種因素的影響[2]，治療也具有多樣性，中醫(yī)藥以其多成分多靶點多通路的特點，在OP的治療中具有獨特的優(yōu)勢。

OP屬于中醫(yī)“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范疇，參考《中西醫(yī)結(jié)合風濕免疫病學》《中醫(yī)診斷學》和中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥相關專家共識，可歸納常見證型為肝腎陰虛證、腎陰陽兩虛證、脾腎陽虛證、腎虛血瘀證[3-4]?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》記載：“腎生骨髓，髓生肝”。《醫(yī)經(jīng)精義》云：“髓者腎精所生，精足則髓充，髓充者則骨強”。臨床常用獨活寄生湯進行治療，取其補益肝腎、祛濕止痛之效，方中以獨活和桑寄生為君藥，獨活，味辛、苦，性微溫，歸腎、膀胱經(jīng)，具有祛風除濕，止痛，解表之功效，為治風濕痹痛的主藥；桑寄生，味苦、甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風濕，補肝腎，強筋骨的功效，《本草求真》謂其為補腎補血要劑，兩藥合用，共奏補益肝腎，祛痹止痛之效。然而基礎研究中關于獨活寄生湯治療OP的相關報道較為少見，其作用機制也尚未明確，故選取獨活-桑寄生藥對，分析其有效成分、作用靶點及潛在機制，為其臨床推廣應用提供科學依據(jù)，也為進一步探究獨活寄生湯治療OP的作用機制奠定基礎。

網(wǎng)絡藥理學結(jié)合多學科知識和方法，具有系統(tǒng)性、整體性的特點。中藥深入研究的過程，常因藥物成分多、靶點及作用途徑復雜，致使研究較為困難。網(wǎng)絡藥理學的優(yōu)勢為研究中藥提供了新的方向，可從整體角度系統(tǒng)分析藥物對疾病的干預和影響，揭示中藥作用的物質(zhì)基礎和分子機制[5]。本研究使用網(wǎng)絡藥理學的方法，從分子水平探索獨活-桑寄生治療OP的作用機制，為進一步研究和臨床推廣應用提供參考。

1 數(shù)據(jù)獲取和處理

1.1 中藥成分及靶點篩選

本研究首先在TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中輸入中藥名稱“獨活”“桑寄生”為檢索詞獲取兩種藥物的化學成分，并通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進行補充，將滿足篩選條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug likeness，DL)≥0.18的結(jié)果保留即為獨活和桑寄生的有效成分。將所得的有效成分通過SymMap數(shù)據(jù)庫(https://www.symmap.org)獲得其相應靶點，并利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)篩選物種為“homo sapiens”的靶點，即獨活-桑寄生主要成分的預測靶點。綜合可得到藥物-成分-靶點關聯(lián)數(shù)據(jù)。

1.2 OP相關靶點搜集

以“Osteoporosis”為關鍵詞通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)檢索與骨質(zhì)疏松癥有關聯(lián)的靶點。

1.3 中藥作用疾病的潛在靶點預測

將上述獲得的藥物靶點和疾病靶點輸入OmicShare云平臺(http://www.omicshare. com)維恩圖模塊進行映射，篩選出獨活-桑寄生與OP的共標靶點，此共標靶點即為本研究中藥治療疾病的潛在作用靶點。

1.4 數(shù)據(jù)網(wǎng)絡構(gòu)建

通過Cytoscape3.6.0軟件中“Network Analyze”分析網(wǎng)絡拓撲參數(shù)功能，將篩選得到的獨活-桑寄生治療OP的潛在作用靶點和2.1中藥物-成分-靶點相關數(shù)據(jù)導入軟件，并分析得到網(wǎng)絡拓撲參數(shù)篩選核心成分和靶點。

1.5 GO富集分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)獲得獨活-桑寄生治療OP潛在靶點的Gene ID，并將此數(shù)據(jù)通過Ensembl基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/index.html)轉(zhuǎn)化為Ensembl Gene ID。在OmicShare云平臺動態(tài)GO富集分析模塊進行分析，將輸出結(jié)果滿足限定條件P<0.01，F(xiàn)DR<0.01的進行保留，并按照P值從小到大排序，選取前20個GO條目繪制成高級氣泡圖。

1.6 KEGG 通路富集分析

通過DAVID6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov)對獨活-桑寄生治療Osteoporosis的潛在靶點進行KEGG通路富集分析，將輸出結(jié)果滿足限定條件P<0.01，F(xiàn)DR<0.01的進行保留，刪除其中疾病相關信號通路后按照P值從小到大排序，選取前10條在OmicShare云平臺高級氣泡圖模塊繪制成圖。

2 結(jié)果

2.1 中藥作用疾病的潛在靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到獨活化合物96個，桑寄生化合物9個，限定條件下篩選出兩味中藥活性化合物共41個，共預測靶標355個。同時將檢索得到的4 091個OP相關靶點進行維恩圖映射，并取交集，得到138個中藥治療疾病的潛在作用靶點，見如圖1。潛在靶點對應活性成分共39個，其所在藥物和相應的潛在靶點如表1所示。

圖1 獨活-桑寄生和OP的靶點維恩圖Fig.1 Target Venn diagram of angelica pubescens radix-loranthaceae and OP

2.2 網(wǎng)絡分析結(jié)果

網(wǎng)絡拓撲參數(shù)分析結(jié)果中參數(shù)節(jié)點連接度(degree)和介數(shù)中心性(Betweenness Centrality)的數(shù)值可表示其在網(wǎng)絡中的重要性。本研究篩選節(jié)點連接度>均值(7.667)且介數(shù)中心性>均值(0.031)的核心成分共3個，分別為Quercetin(槲皮素)、Osthol(蛇床子素)、Psoralen(補骨脂素)；篩選節(jié)點連接度>均值(1.884)且介數(shù)中心性>均值(0.003)的核心靶點共24個，具體信息如表2所示。其中前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1(PTGS1)、雌激素受體α(ESR1)、β-2腎上腺素能受體(ADRB2)的關鍵參數(shù)較其他潛在靶點更高，可能為獨活-桑寄生治療OP的關鍵靶點。根據(jù)中藥-活性成分-潛在靶點數(shù)據(jù)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡見如圖2，共有179個節(jié)點、299條線，其中黃色菱形代表中藥，藍色正方形代表潛在靶點，綠色圓形代表獨活-桑寄生的活性成分，節(jié)點大小與節(jié)點連接度成正比。

圖2 獨活-桑寄生治療OP的中藥-活性成分-潛在靶點網(wǎng)絡Fig.2 Traditional Chinese medicine-active ingredients-potential target network of angelica pubescens radix-loranthaceae for OP therapy

表1 獨活-桑寄生治療OP的活性成分及相應靶點Table 1 Active components and corresponding targets of angelica pubescens radix-loranthaceae therapy for OP

2.3 GO富集分析和KEGG通路富集

GO富集分析結(jié)果以P<0.01，F(xiàn)DR<0.01為篩選條件，可得到生物過程(biological process，BP)2 509條，包括對含氧化合物的反應(response to oxygen-containing compound)、對有機物的反應(response to organic substance)、細胞對化學刺激的反應(cellular response to chemical stimulus)等；分子功能(molecular function，MF)193條，包括對酶結(jié)合(enzyme binding)、同一蛋白結(jié)合(identical protein binding)、信號受體結(jié)合(signaling receptor binding)、蛋白酶結(jié)合(protease binding)、細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)等；細胞組成(cell composition，CC)113條，包括膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)等。GO富集結(jié)果制作的高級氣泡圖中氣泡越大代表富集在該條目上的基因個數(shù)越多；氣泡的顏色越紅，表示該條目的P值越小(見圖3～5)。KEGG通路富集篩選可得到12條KEGG 通路富集結(jié)果，包括腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)、低氧誘導因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)等。選取前10條繪制成高級氣泡圖(見圖6)。

圖3 獨活-桑寄生治療OP GO生物過程富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO BP enrichment in the treatment of osteoporosis with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖4 獨活-桑寄生治療OP GO分子功能富集氣泡圖Fig.4 Bubble chart of GO MF enrichment in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖5 獨活-桑寄生治療OP GO細胞組成富集氣泡圖Fig.5 Bubble chart of GO CC enrichment in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

圖6 獨活-桑寄生治療OP KEGG通路富集的氣泡圖Fig.6 Bubble chart of enrichment of KEGG pathway in the treatment of OP with angelica pubescens radix-loranthaceae

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病與體內(nèi)成骨細胞的骨形成和破骨細胞的骨溶解、骨吸收間動態(tài)平衡的破壞密切相關[6-7]。研究表明，炎癥是導致骨質(zhì)疏松癥的直接因素[8]，NF-κB 和JNK的激活，可增強破骨細胞的增殖分化能力[9-10]；TNF-α也可導致骨質(zhì)疏松癥，其途徑是通過刺激骨髓間充質(zhì)干細胞誘導形成破骨細胞[11]。氧化應激也可打破成骨細胞和破骨細胞的動態(tài)平衡，造成骨質(zhì)疏松的發(fā)生。Li等[12]使用地塞米松處理成骨前體細胞 MC3T3-E 細胞后，發(fā)現(xiàn)細胞中 ROS 水平和成骨細胞的凋亡率均顯著升高，繼而導致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

3.1 核心成分和OP

本研究篩選出核心成分為槲皮素、蛇床子素和補骨脂素。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化的作用，研究表明[13-14]槲皮素可通過提高巨噬細胞的吞噬功能、影響細胞因子和炎癥介質(zhì)的分泌，達到抗炎的作用。也有研究表明，槲皮素還可通過抑制脂質(zhì)過氧化、清除ROS，達到減輕氧化應激損傷的作用[15-16]。機體內(nèi)炎癥反應和氧化應激之間存在相互作用，相互影響，槲皮素對其均具有調(diào)節(jié)作用，進而緩解骨質(zhì)疏松的發(fā)展。鄭紅等[17]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過升高骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2)的表達，促進成骨細胞分化，從而緩解OP。郝芳卉等[18]、張宇等[19]實驗研究表明蛇床子素可通過抑制TNF-α和TLR4/NF-κB 通路的表達，抑制炎性反應。蛇床子素也可通過抑制NF-κB 信號通路的表達，達到下調(diào)活化T細胞核因子(NFATc1)等相關轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而抑制破骨細胞的分化成熟；同時可通過作用于Wnt/β-catenin、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等信號通路，促進成骨細胞的增殖和分化[20-21]。補骨脂素具有抗炎和抗氧化的作用，研究表明，補骨脂素能顯著抑制hPDLCs炎癥因子的表達，同時對H2O2誘導的細胞損傷具有保護作用[22-23]。黃奎等[24-25]通過檢測小鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)下血清I型膠原羧基末端肽水平和股骨生物力學性能，提示補骨脂素可抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)化率。

3.2 關鍵靶點和OP

本研究篩選的關鍵靶點包括PTGS2、PTGS1、ESR1、ADRB2等。PTGS2和PTGS1分別為PTGS的兩種同工酶，具有抗炎和抗氧化的作用。目前研究發(fā)現(xiàn)[26]，PTGS2參與各種炎性毛細血管后微靜脈的通透性、白細胞的趨化作用、T淋巴細胞產(chǎn)生。湯雁利等[27]研究發(fā)現(xiàn)康復新可通過降低PTGS2的表達，在巨噬細胞炎癥反應中起到抗炎作用。PTGS1在炎癥、關節(jié)炎疾病和癌癥的病理生理進程中起著關鍵作用[28]。研究表明，藥物抑制或基因沉默PTGS1的表達可降低LPS誘導的炎癥反應，其機制可能通過負調(diào)控NF-κB信號通路起作用[29-30]。ESR1是雌激素受體(ESR)中的一種，存在于成骨細胞、破骨細胞和骨細胞中，雌激素通過與ESR1結(jié)合發(fā)揮作用。Fatima等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，在ESR1敲除雌性小鼠的腹股溝和性腺白色脂肪組織中，促炎細胞因子血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)[32-33]的表達降低，提示E2 / ESR1在增強血管生成，減少炎癥等功能中具有重要意義。ADRB2表達的β2腎上腺素受體(β2-AR)廣泛存在于免疫細胞中。研究發(fā)現(xiàn)，在人和鼠的樹突狀細胞中，刺激 β2-AR 能夠激活 NOD2 信號，進而促進 T 細胞分化，并調(diào)控相關細胞因子的分泌和炎癥反應[34]。

4 結(jié)論

基于網(wǎng)絡藥理學，可預測得到獨活-桑寄生中有效成分槲皮素、蛇床子素和補骨脂素等，通過作用于PTGS2、PTGS1、ESR1、ADRB2等靶點，從而影響含氧化合物的反應、對有機物的反應、細胞對化學刺激的反應等生物過程和腫瘤壞死因子、低氧誘導因子-1、PI3K-Akt等信號通路，達到抗炎和抗氧化的作用，進而治療OP。后期可通過實驗對其進行驗證，完善基于網(wǎng)絡藥理學的預測，為明晰其作用機制和藥物的推廣應用提供更高等級的循證證據(jù)。