影響大孔樹脂純化狼爪瓦松愈傷組織多糖的幾種因素研究

李學(xué)峰， 韓 璐， 劉懿萱， 徐亞男， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

狼爪瓦松(OrostachyscartilagineaA. Ber)為景天科瓦松屬的一種2年生或多年生的草本植物[1]，在我國(guó)主要分布于山東、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等省區(qū)，它既具有優(yōu)異的觀賞應(yīng)用價(jià)值，又是一種頗具開發(fā)價(jià)值的野生花卉[2]。狼爪瓦松含多糖類、黃酮類、酚類、有機(jī)酸類以及甾醇類等多種有效成分[3]，具有抑菌、抗病毒、抗氧化、抗癌、降血脂、降血壓等藥理作用。植物多糖已被認(rèn)為具有多種藥理作用，如清除自由基，降血脂、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫活性、抗突變、抗病毒、抗菌及抗腫瘤等作用，在保健品、藥品生產(chǎn)等領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越廣泛[4-7]。同時(shí)狼爪瓦松愈傷組織中富含多種有效成分，其中多糖是含量較高的一種。因此，通過(guò)對(duì)狼爪瓦松愈傷組織中多糖進(jìn)行提純來(lái)進(jìn)一步研究其功效及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與生產(chǎn)。

大孔樹脂具有多孔結(jié)構(gòu)和材料性質(zhì)，其吸附分離技術(shù)同時(shí)兼具機(jī)械篩分和化學(xué)吸附的特點(diǎn)，干擾因素少，選擇性高，可以重復(fù)循環(huán)利用，多用于黃酮、多糖和多酚等生物活性物質(zhì)的提純[8]。楊波等[9]在AB-8和D101大孔吸附樹脂分離純化玉竹多糖研究中發(fā)現(xiàn)，D101和AB-8樹脂都有利于提高多糖的純化，劉紅梅等[10]在S-8大孔樹脂對(duì)灰樹花子實(shí)體多糖酶解液色素吸附的影響的研究中發(fā)現(xiàn)，S-8型樹脂有利于灰樹花子實(shí)體的多糖純化，劉明等[11]在柴達(dá)木枸杞果渣中黃酮和多糖的制備工藝研究中發(fā)現(xiàn)，HP-20型樹脂對(duì)柴達(dá)木枸杞有很好的多糖純化作用。由此可見，D101、AB-8、S-8和HP-20這4種型號(hào)的樹脂均對(duì)植物多糖純化有效。由于狼爪瓦松被過(guò)度采摘導(dǎo)致其野生資源越來(lái)越少，加上人工栽培體系尚未完善，嚴(yán)重影響著狼爪瓦松的進(jìn)一步開發(fā)和利用。所以，通過(guò)生物反應(yīng)器可在中短期內(nèi)培養(yǎng)出大量狼爪瓦松愈傷組織，是獲取植物原材料的一種有效途徑[12-13]。因此，該研究利用大孔吸附樹脂法對(duì)愈傷組織中的多糖進(jìn)行純化，旨在為狼爪瓦松愈傷組織多糖的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照張萬(wàn)博[14]的方法進(jìn)行狼爪瓦松愈傷組織的增殖培養(yǎng)。在25 d后收獲愈傷組織，用流水充分沖洗，在45 ℃恒溫箱中烘干后作為該研究的試驗(yàn)材料。將愈傷組織干品浸泡在70%的乙醇(料液比為 1∶15)中，60 ℃下冷凝回流1 h后，抽濾，收集濾渣。濾渣再次進(jìn)行冷凝回流，重復(fù)3次。合并濾渣，揮干乙醇后，用100 ℃熱水提取1 h，提取3次，將每次抽濾的濾液進(jìn)行合并，減壓濃縮，加入乙醇沉淀離心，即得愈傷組織多糖粗提物，用于之后試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

將所需的大孔樹脂浸泡在95%乙醇溶液中，浸泡24 h 后上柱，并使用95%乙醇溶液充分沖洗樹脂柱，再用蒸餾水繼續(xù)沖洗，直至流出溶液無(wú)乙醇味。將處理好的樹脂加入4%的鹽酸溶液浸泡樹脂4 h，之后用蒸餾水沖洗，至流出液體的pH值呈中性。最后使用4%的氫氧化鈉浸泡樹脂4 h，之后用蒸餾水沖洗，至流出液體的pH值呈中性。

1.2.2 大孔吸附樹脂種類的篩選

利用靜態(tài)吸附法[15]篩選樹脂種類。試驗(yàn)用4種大孔吸附樹脂(D101、AB-8、S-8和HP-20)購(gòu)于廊坊麥克森化工建材有限公司(河北，中國(guó))。將狼爪瓦松愈傷組織粗提物用蒸餾水稀釋到0.8 mg/mL后，測(cè)定其多糖濃度(C0)。將3 g預(yù)處理后的大孔吸附樹脂樹后放入200 mL三角瓶中，加入20 mL(V1)的稀釋粗提物(0.8 mg/mL)，使樹脂吸附多糖，4 h后抽濾，并測(cè)定濾液中多糖含量(C1)。抽濾后的樹脂再次置入三角瓶中，加入20 mL(V2)的95%乙醇洗脫多糖。4 h后抽濾，收集濾液，測(cè)定多糖含量(C2)。根據(jù)測(cè)定的多糖吸附率及解吸率，選擇出供試驗(yàn)的最佳樹脂種類。

吸附率/%= (C0C1)/C0100

解吸率/%=(C2V2) / (C0C1)V1100

1.2.3 進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積、進(jìn)料流速的篩選

根據(jù)大孔樹脂種類試驗(yàn)結(jié)果，選用AB-8樹脂進(jìn)行預(yù)處理，并注入樹脂柱(柱徑∶柱高=1∶10)，試驗(yàn)方法如下。

1) 進(jìn)樣濃度篩選試驗(yàn)：將粗提物濃度設(shè)置為1.2、1.3、1.4、1.5 mg/mL后，分別進(jìn)樣，進(jìn)料流速為1 BV/h(BV為樹脂柱體積)，進(jìn)料總體積為2 BV。

2) 進(jìn)料體積篩選試驗(yàn)：進(jìn)樣濃度設(shè)置為(1)中最佳濃度，將進(jìn)料流速調(diào)節(jié)至1 BV/h，進(jìn)料總體積為3.5 BV，每進(jìn)料0.25 BV收集1次流出液體。

3) 進(jìn)料流速篩選試驗(yàn)：進(jìn)料流速分別設(shè)置為1、2、3 BV/h，進(jìn)樣濃度為試驗(yàn)1)中最佳濃度，進(jìn)料體積為試驗(yàn)2)中最佳體積。

所有處理中均收集流出液，減壓濃縮并干燥，稱取干燥后的多糖0.01 g，用蒸餾水定容至100 mL，測(cè)定多糖濃度，判斷多糖吸附情況，篩選出最佳處理。

1.2.4 洗脫劑濃度、洗脫劑體積和洗脫流速的篩選

洗脫劑濃度篩選采用靜態(tài)吸附試驗(yàn)法，以乙醇作為洗脫劑。取3 g預(yù)處理的AB-8樹脂放入三角瓶中，加入0.8 mg/mL的粗提物20 mL，4 h后抽濾。將抽濾后的樹脂再次置于三角瓶中，并加入20 mL不同濃度的乙醇(55%、65%和75%)浸泡4 h后抽濾。收集濾液減壓濃縮，用蒸餾水定容至10 mL后測(cè)定多糖濃度，判斷多糖解吸情況，篩選洗脫劑濃度。

為了篩選洗脫劑體積和洗脫流速，預(yù)處理的AB-8樹脂上柱后，加入粗提取，進(jìn)樣濃度、進(jìn)樣體積、進(jìn)樣流速均調(diào)節(jié)為試驗(yàn)1.2.3中篩選出的最佳條件。進(jìn)樣過(guò)程結(jié)束后，用蒸餾水沖洗樹脂柱，直至流出液體無(wú)色后，加入55%乙醇進(jìn)行多糖解吸。

1) 洗脫劑體積篩選試驗(yàn)：洗脫流速調(diào)節(jié)為1 BV/h，每0.25 BV洗脫劑后進(jìn)行1次流出液體收集，直至加入3 BV的洗脫劑。

2) 洗脫流速篩選試驗(yàn)：洗脫劑體積調(diào)節(jié)為試驗(yàn)1)中最佳洗脫劑體積，洗脫流速分別設(shè)置為1、2、3 BV/h。

所有處理中，收集流出液體，并進(jìn)行減壓濃縮并干燥，稱取干燥后的多糖0.01 g用蒸餾水定容至100 mL，測(cè)定多糖濃度，判斷多糖解吸情況，篩選出最佳處理。

1.2.5 多糖濃度的測(cè)定

參照張青等[16]的方法測(cè)定多糖的含量。為了繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取100 mg干燥的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，用蒸餾水溶解定容至100 mL，分別取0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25和1.5 mL用蒸餾水定容至10 mL后，配制成不同濃度。各濃度的葡萄糖溶液1 mL中分別加入1 mL的5 %苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，空白對(duì)照為蒸餾水，反應(yīng)30 min后測(cè)定490 nm處的吸光值，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

為測(cè)定樣品溶液中的多糖含量，取樣品溶液1 mL依次加入1 mL 5 %苯酚溶液和5 mL的濃硫酸，反應(yīng)30 min后測(cè)定490 nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)處理均設(shè)置3次重復(fù)。利用Graphpad Prism 7軟件程序，采用鄧肯式新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 狼爪瓦松愈傷組織粗提物

用5 L氣升式生物反應(yīng)器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織，在25 d時(shí)可以收獲鮮重為700 g的狼爪瓦松愈傷組織，并進(jìn)行烘干。將愈傷組織干品用蒸餾水提取后可以獲得5.5 g粗提物，提取率為17%，對(duì)粗提物的活性物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)多糖含量為381.0 mg/g。將得到的粗提物用于進(jìn)一步的多糖純化。

2.2 大孔樹脂種類的篩選

不同種類的大孔吸附樹脂對(duì)狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附和解脫的效果不同。從狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附的結(jié)果看出，AB-8和S-8樹脂對(duì)多糖的吸附率明顯高于D101和HP-20樹脂，吸附率達(dá)96%以上，說(shuō)明AB-8和S-8 2種樹脂能夠較好地吸附狼爪瓦松愈傷組織多糖。從解吸狼爪瓦松愈傷組織多糖的情況來(lái)看，用乙醇作為洗脫劑進(jìn)行洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D101和AB-8樹脂的解吸率顯著高于S-8和HP-20樹脂(圖1)。綜上所述，AB-8樹脂的吸附率和解吸率明顯高于其它種類的樹脂，所以，該研究選用AB-8大孔樹脂進(jìn)行進(jìn)一步的狼爪瓦松愈傷組織多糖純化條件的研究。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)。字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.3 進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積和進(jìn)料流速對(duì)狼爪瓦松愈傷組織多糖吸附的影響

采用動(dòng)態(tài)吸附法對(duì)進(jìn)樣濃度、進(jìn)料體積及進(jìn)料流速對(duì)大孔樹脂吸附多糖的影響進(jìn)行了研究。當(dāng)進(jìn)樣濃度為1.3 mg/L時(shí)，吸附率顯著高于進(jìn)樣濃度1.2、1.4和1.5 mg/L(圖2)，說(shuō)明此濃度樹脂可以很好地吸附多糖，因此，選用進(jìn)樣濃度為1.3 mg/mL。在進(jìn)料體積為0.5～2 BV時(shí)，隨進(jìn)料體積的增加流出液中多糖濃度緩慢增加；但進(jìn)料體積超過(guò)2 BV時(shí)，吸附率急劇降低(圖3)，說(shuō)明進(jìn)料體積為2 BV時(shí)，樹脂吸附多糖的量已接近飽和，繼續(xù)添加樣品，多糖會(huì)泄露，會(huì)造成樣品浪費(fèi)。進(jìn)料流速對(duì)樹脂吸附多糖的影響也很大，流速越高多糖泄露越多，當(dāng)進(jìn)料流速為1 BV/h時(shí)，流出液中多糖含量顯著低于進(jìn)料流速為2和3 BV/h(圖4)。說(shuō)明1 BV/h進(jìn)料流速下，樹脂可很好地吸附多糖。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上有顯著差異。

圖3 進(jìn)料體積對(duì)多糖吸附的影響

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

2.4 洗脫劑的濃度、體積和流速對(duì)狼爪瓦松愈傷組織多糖解吸的影響

以乙醇作為洗脫劑，當(dāng)洗脫劑濃度為65%時(shí)，樹脂對(duì)多糖的解吸率顯著高于55%和75%，說(shuō)明用65%洗脫劑對(duì)樹脂進(jìn)行洗脫時(shí)，樹脂吸附的多糖可最大程度地解吸下來(lái)(圖5)。

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

進(jìn)一步采用動(dòng)態(tài)附法對(duì)洗脫劑體積和洗脫流速對(duì)多糖解吸的影響進(jìn)行了測(cè)定。當(dāng)洗脫劑體積0.25～1.25 BV時(shí)，隨著洗脫劑體積的增加，流出液中多糖濃度增加，洗脫劑體積繼續(xù)增加后，多糖濃度下降，當(dāng)洗脫劑體積達(dá)到2.5 BV時(shí)，多糖濃度不再減少，說(shuō)明2.5 BV的洗脫劑可以最大量地將多糖解吸出來(lái)，是較為適宜的洗脫劑體積(圖6)。因此，對(duì)不同洗脫流速的影響進(jìn)行調(diào)查時(shí)，使用洗脫劑體積為2.5 BV。當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，流出液的多糖高于1和3 BV/h組，說(shuō)明當(dāng)洗脫流速為2 BV/h時(shí)，對(duì)多糖解吸效果較好，因此，選擇2 BV/h為最佳的洗脫流速(圖7)。

圖6 洗脫劑體積對(duì)多糖解吸的影響

注：數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)，圖中的字母表示在0.05水平上差異顯著。

3 結(jié)論與討論

高效、安全地提取植物中天然生物活性物質(zhì)是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。目前，已經(jīng)開發(fā)出多種提純方法來(lái)提純天然活性物質(zhì)，如超臨界流體萃取法[17]、高速逆流色譜法、雙水相萃取法、高效液相色譜法等，然而這些方法在應(yīng)用中存在對(duì)環(huán)境造成污染、操作過(guò)程復(fù)雜、人工成本高、不適合工業(yè)化大量生產(chǎn)等缺點(diǎn)。因此，尋找一種操作簡(jiǎn)單、高效率、低成本的純化方法極為重要。大孔吸附樹脂是一種高分子合成材料，具有良好的吸附性質(zhì)和解脫性，同時(shí)可以重復(fù)利用，可以高效、簡(jiǎn)單、環(huán)保、節(jié)能地純化植物中的天然活性物質(zhì)[18]。目前已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用在天然活性物質(zhì)的純化和分離，如黃酮、多酚和多糖類化合物的純化。研究發(fā)現(xiàn)，AB- 8型樹脂對(duì)植物多糖具有良好的吸附和解析作用，可以用來(lái)純化植物多糖。張濤濤[19]在大孔樹脂純化杜仲多糖工藝研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)上樣濃度為0.6 mg/mL，以1.0 mL/min流速上樣至AB-8型大孔樹脂吸附后，用150 mL的65%乙醇溶液，以1.0 mL/min流速洗脫時(shí)，樹脂對(duì)多糖的吸附率和解吸率分別為90.6%和90.2%，最終多糖含量可達(dá)到35.8%。孫偉等[20]用大孔樹脂純化桑白皮多糖的工藝研究中發(fā)現(xiàn)，D-101 型大孔吸附樹脂分離純化桑白皮多糖的最佳上樣條件為：pH值3.0，上樣速度為2.0 BV/h，上樣濃度為4.0 mg/h。而最佳洗脫條件為75%的乙醇洗脫劑用量為3.5 BV、流速為1.0 BV/h，經(jīng)過(guò)該工藝純化后，秦白皮多糖的純度達(dá)到74.55%。邱曉[21]在黨參多糖的提取純化工藝及應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，黨參多糖分離純化工藝的上樣濃度10 mg/mL、上樣體積160 mL、柱徑高比1∶8、洗脫液為5%乙醇溶液，所得固體產(chǎn)物中黨參多糖的含量為25.12%。同樣，該試驗(yàn)也得出AB-8為純化狼爪瓦松愈傷組織中多糖的最優(yōu)樹脂，但進(jìn)料濃度、流速、體積以及洗脫劑濃度、流速、體積與其它研究有差異，這可能與不同植物所含多糖種類不同相關(guān)。該研究中，大孔吸附樹脂對(duì)狼爪瓦松愈傷組織多糖純化的最佳條件是進(jìn)樣濃度為1.5 mg/mL，進(jìn)樣體積為2 BV，進(jìn)樣流速為1 BV/h，洗脫劑濃度為65%，洗脫劑體積為2.5 BV，洗脫流速為2 BV/h。可以得出用大孔吸附樹脂對(duì)狼爪瓦松愈傷組織多糖進(jìn)行純化具有可行性。該結(jié)果為今后狼爪瓦松愈傷組織多糖純化提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為狼爪瓦松資源的有效開發(fā)利用提供新途徑，且大孔樹脂的成本低廉、操作簡(jiǎn)單、效率高，可為今后大規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)參考。