東北刺人參不定根總黃酮提取工藝的優(yōu)化及其抗氧化活性的研究

吳曉晗， 范明智， 李學(xué)峰， 廉美蘭， 樸炫春

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

東北刺人參(OplopanaxselatusNakai)，又稱刺參或刺人參，為五加科刺參屬多年生藥用植物，主要分布于吉林省長白山區(qū)，俄羅斯、朝鮮也少有分布，是我國二級保護(hù)植物[1]。東北刺人參根較長且粗大，耐寒，但懼怕陽光直射，含有多種活性物質(zhì)，主要包括黃酮類、總酚類、蒽醌類、多糖類、皂苷類、揮發(fā)油、不飽和脂肪酸和微量元素等[2-3]，具有抗真菌、抗氧化、預(yù)防腫瘤、抗衰老、鎮(zhèn)痛、解熱、補(bǔ)氣助陽等功效[4-5]。

黃酮類物質(zhì)作為植物體內(nèi)的重要次生代謝產(chǎn)物之一，可作為一種天然的抗氧化劑進(jìn)行開發(fā)利用，具有延緩衰老、防治疾病的作用[6]，其以純天然，高活性，見效快等優(yōu)點(diǎn)引起專家學(xué)者的廣泛關(guān)注[7]。目前，大量關(guān)于東北刺人參的藥理活性研究圍繞著黃酮類物質(zhì)展開。王廣樹等[8]試驗(yàn)從東北刺人參葉片中分離出黃酮苷，根據(jù)光譜測定結(jié)構(gòu)，確定了山萘黃素等黃酮類化合物。陳紅梅等[9]研究結(jié)果表明，黃酮類化合物具有較強(qiáng)清除自由基和抗氧化能力等的一類物質(zhì)。曲淑巖等[10]通過用東北刺人參乙醇提取物對小鼠進(jìn)行灌胃試驗(yàn)，結(jié)果表明小鼠的耐缺氧能力提高體內(nèi)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)有抗衰老的效果，從而證明東北刺人參具有抗衰老作用。而近年調(diào)查表明，天然東北刺人參已經(jīng)寥寥無幾，野生資源極度短缺[11]。在東北刺人參稀缺的情況下，生物反應(yīng)器成為組培快繁的重要方式[12]，相比于其他培養(yǎng)方式而言，其具有生產(chǎn)成本較低，可周年生產(chǎn)，不受季節(jié)條件限制等優(yōu)點(diǎn)，可為植物生長和代謝提供良好的環(huán)境，從而得到更多的生物量和代謝產(chǎn)物。目前李慧娟[13]已建立東北刺人參不定根反應(yīng)器培養(yǎng)體系，而不定根總黃酮提取工藝的研究尚未見報(bào)道，因此，該試驗(yàn)以生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根為試驗(yàn)材料，在不同的提取溶劑、時(shí)間、溫度、次數(shù)和料液比條件下，對東北刺人參不定根中總黃酮含量進(jìn)行測定，并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 進(jìn)行了四因素三水平正交試驗(yàn), 從而優(yōu)化東北刺人參不定根總黃酮的提取工藝。由于黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化作用, 因此在東北刺人參不定根總黃酮的最佳提取工藝條件下采用DPPH、ABTS和鐵離子螯合力等3種方法評價(jià)了在最佳條件下東北刺人參不定根提取物的抗氧化活性，旨在為東北刺人參不定根應(yīng)用于化妝品相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

參照于丹[14]的試驗(yàn)方法，對東北刺人參不定根進(jìn)行增殖。將增殖培養(yǎng)后的不定根切成約1 cm小段，稱取不定根20 g(鮮重)將其接種于氣球型氣升式生物反應(yīng)器內(nèi)。培養(yǎng)基為MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L，pH值5.8。將反應(yīng)器的通氣量設(shè)置為75 mL/min，在25 ℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，45 d后收獲。將收獲的不定根用水沖洗3次，瀝干后放入烘干箱中進(jìn)行干燥，烘干后的不定根干品即為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 不定根提取溶劑的篩選

精密稱取東北刺人參不定根干品1 g，放置在燒瓶內(nèi)，分別加入乙醇、甲醇、水，利用超聲提取法，在50 ℃和40 kHz的頻率下提取1 h后過濾。重復(fù)2次后合并濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液進(jìn)行減壓濃縮至膏狀物，將濃縮的膏狀物置于45 ℃的烘干箱中干燥直至恒重后進(jìn)行總黃酮含量的測定。

1.2.2 不定根提取濃度的篩選

將東北刺人參不定根干品1 g浸泡在乙醇中,研究在不同乙醇濃度條件下東北刺人參不定根提取物對總黃酮含量的影響。按照1.2.1方法制備提取物,將乙醇濃度設(shè)置為25%、50%、75%和100%,測定不同濃度的提取物對總黃酮含量的影響,確定提取溶劑的最佳濃度。

1.2.3 不定根提取時(shí)間、次數(shù)、溫度以及料液比的篩選

將不定根干品1 g置于50%的乙醇中，研究在不同提取時(shí)間、溫度、次數(shù)以及料液比的條件下，提取工藝對不定根中總黃酮含量的影響。按照1.2.1方法提取不定根提取物，通過測定總黃酮含量，依次確定最適宜的提取工藝條件。

1) 提取時(shí)間試驗(yàn)：將提取時(shí)間設(shè)置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h, 在50℃，料液比為1∶30 (g∶mL)的條件下，提取2次后對總黃酮含量進(jìn)行測定，其他提取物提取方法同1.2.1；

2) 提取次數(shù)試驗(yàn)：以提取時(shí)間試驗(yàn)中不定根中黃酮含量最高的時(shí)間作為提取條件，將提取次數(shù)分別設(shè)置為1、2、3、4、5次后對總黃酮含量進(jìn)行測定，其他提取物制備方法同1.2.1；

3) 提取溫度試驗(yàn)：以提取次數(shù)試驗(yàn)中不定根中黃酮含量最高的次數(shù)作為提取條件，將提取溫度設(shè)置為30、50、70、90 ℃后對總黃酮含量進(jìn)行測定，其他提取物制備方法同1.2.1；

4) 料液比試驗(yàn)：以提取溫度試驗(yàn)中不定根中總黃酮含量最高的溫度為提取條件，將料液比設(shè)置為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 (g∶mL)后對總黃酮含量進(jìn)行測定，其他提取物制備方法同1.2.1。

1.2.4 總黃酮提取工藝的優(yōu)化

參照上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，選不同提取時(shí)間、溫度、次數(shù)以及料液比4個單因素，以東北刺人參不定根提取物中總黃酮的含量作為指標(biāo)，設(shè)定4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)(表1)，確定最佳的提取工藝。然后根據(jù)正交試驗(yàn)中最佳提取工藝的條件，對其進(jìn)行重復(fù)3次的驗(yàn)證試驗(yàn)，以此確定該條件是否具有穩(wěn)定性。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 總黃酮含量的測定方法

東北刺人參不定根不同溶劑提取物中總黃酮含量的測定方法參照Chang[15]的方法并稍加改動。精密稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用75%乙醇溶液定容至250 mL配制成濃度為40 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液以及各樣品待測液1.0 mL于試管中定容至2.0 mL。向每根試管中加入5%的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，充分搖勻6 min，最后加入4%的NaOH溶液2.0 mL。用紫外分光光度計(jì)(UV1102紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司，中國)在510 nm下測定吸光值OD，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測樣品溶液濃度，總黃酮含量按下述公式計(jì)算。

總黃酮含量/mg·g-1=CVD/m

式中,C為待測樣品溶液濃度;V為待測樣品溶液體積;D為稀釋倍數(shù);m為干品質(zhì)量

1.2.6 抗氧化活性的測定

1) 清除DPPH自由基活性測定 參照Noie[16]的方法對DPPH自由基清除能力進(jìn)行測定。精密稱取40 mg的提取物定容至20 mL，樣品濃度為2.0 mg/mL，將上述溶液依次稀釋至濃度為0.012 5、0.025、0.05 、0.1、0.2、0.4 、0.6、0.8和1 mg/mL的待測樣品溶液，將抗壞血酸(VC，Sigma公司，美國)配置為等濃度溶液作為陽性對照。稱取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，索萊寶公司，中國)粉末0.003 9 g，用甲醇溶液定容至100 mL。向試管中加入2 mL待測樣品溶液，再加入2 mL的DPPH溶液，為待測樣品組?？瞻讓φ战M用2 mL甲醇代替待測樣品。避光靜置30 min后用紫外分光光度計(jì)在517 nm下測定吸光值OD，按照下述公式計(jì)算出DPPH自由基清除率。

式中，A空為空白對照組吸光值;A樣為待測樣品組吸光值。

2) 鐵離子螯合能力測定 參照Fu等[17]的方法稍作改進(jìn)，對東北刺人參不定根最佳提取溶液的鐵離子螯合能力進(jìn)行測定。稱取100 mg的提取物溶于5 mL蒸餾水中，溶液濃度為20 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.625、1.25、2.5、5.0、10.0和20.0 mg/mL的待測樣品溶液，將檸檬酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，中國)配制成等濃度溶液作為陽性對照。按照表2準(zhǔn)確吸取待測樣品溶液、蒸餾水、FeCl2(sigma公司，美國)溶液、菲洛嗪(sigma公司，美國)溶液于96孔板中，于室溫中靜置10 min。用酶標(biāo)儀(iMark酶標(biāo)儀，Bio-Rad，美國)在562 nm處測吸光值(OD)，并計(jì)算出鐵離子螯合能力。

式中，A樣為待測樣品組吸光值，A對為對照組吸光值;A空為空白組吸光值。

表2 反應(yīng)液的組成

3) 清除ABTS+自由基活性測定 參照Garzon等[18]的方法進(jìn)行ABTS+清除試驗(yàn)，用去離子水配置2.45 mmol/L過硫酸鉀(K2S2O8，麥克林公司，中國)和7 mmol/L的2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，索萊寶公司，中國)混合溶液，室溫避光靜置16 h，配置成ABTS+儲備液。試驗(yàn)前用去離子水將ABTS+儲備液的吸光值稀釋至在734 nm下為(0.700±0.02)。稱取50 mg的提取物，溶于5 mL去離子水中，溶液濃度為10 mg/mL。將上述溶液依次稀釋至濃度為0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10 mg/mL的待測樣品溶液，將VC配置成等濃度溶液作為陽性對照。待測樣品組取0.1 mL待測樣品溶液和3.9 mL ABTS+溶液于試管中。取0.1 mL待測樣品溶液和3.9 mL去離子水于試管中，而空白對照組向試管中加入0.1 mL甲醇溶液和3.9 mL ABTS+溶液。搖勻后靜置6 min，用紫外分光光度計(jì)于734 nm下測得吸光值，按照下述公示計(jì)算出ABTS+清除率。

式中，A樣為待測樣品組吸光值；A對為待測樣品對照組吸光值；A空為空白對照組吸光值。

1.2.7 軟件分析及數(shù)據(jù)整理

利用SPSS 22.0(Statistical Product and Service Solutions 22.0)中的方差分析程序分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用鄧肯氏新復(fù)極差法作對比，顯著水平為0.05，每個處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取溶劑對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

分別對不同溶劑提取的東北刺人參不定根提取物中總黃酮含量進(jìn)行測定(圖1)。

圖1 不同提取溶劑對東北刺人參總黃酮含量的影響

不同溶劑間總黃酮含量存在顯著性差異，黃酮含量依次為乙醇>甲醇>水。當(dāng)提取溶劑為乙醇時(shí)，總黃酮的含量明顯高于其他2種溶劑，達(dá)到99.28 mg/g(圖1)。因此，將乙醇設(shè)置為該試驗(yàn)中東北刺人參不定根提取物的最佳提取溶劑。

2.2 不同提取濃度對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

在探究提取溶劑濃度對東北刺人參不定根總黃酮含量的影響時(shí)，將乙醇濃度范圍設(shè)置為25%～100%。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，東北刺人參不定根提取物總黃酮的含量達(dá)到最高，為101.12 mg/g(圖2)。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選用50%的乙醇作為東北刺人參不定根提取的最適濃度。

圖2 不同乙醇濃度對東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 不同提取時(shí)間對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

提取時(shí)間從0.5 h遞加到2 h的過程中，總黃酮含量持續(xù)升高，當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為119.87 mg/g(圖3)，在2 h之后，總黃酮含量顯著降低。因此，適宜的提取時(shí)間確定為2 h。

2.3.2 不同提取溫度對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

當(dāng)提取溫度從30 ℃遞加至50 ℃時(shí)，總黃酮含量呈上升趨勢，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮含量高達(dá)124.53 mg/g(圖4)。但是當(dāng)提取溫度再次升高時(shí)，總黃酮含量開始緩慢降低。因此，適宜的提取溫度確定為50 ℃。

圖3 不同提取時(shí)間對東北刺人參中總黃酮含量的影響

圖4 不同提取溫度對東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.3.3 不同提取次數(shù)對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

不同提取次數(shù)對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響列于圖5。

圖5 不同提取次數(shù)對東北刺人參中總黃酮含量的影響

當(dāng)提取次數(shù)從1次增加至2次時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最高，為129.78 mg/g。在提取次數(shù)為3、4和5次時(shí)，總黃酮含量隨著提取次數(shù)的增加顯著下降(圖5)。因此，選擇的最佳提取次數(shù)為2次。

2.3.4 不同液料比對東北刺人參不定根中總黃酮含量的影響

在提取試驗(yàn)中，料液比是指提取物干重與溶劑體積之比。當(dāng)料液比從1∶20(g∶mL)增加到1∶30 (g∶mL)時(shí)，總黃酮含量大幅升高，達(dá)到99.57 mg/g(圖6)，但料液比超過1∶40(g∶mL)時(shí)，總黃酮含量依次降低。因此，適宜的料液比選定為1∶30(g∶mL)。

圖6 不同提取料液比對東北刺人參中總黃酮含量的影響

2.4 提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定L9(34)正交試驗(yàn)方案，對提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)、提取次數(shù)(C)和料液比(D)4個因素進(jìn)行不同組合，探究這些組合對總黃酮含量的影響，正交試驗(yàn)方案及結(jié)果見表3。

表3中的第4組,提取時(shí)間為2 h、提取溫度為30 ℃、提取次數(shù)為2次、料液比為1∶40 (g∶mL)時(shí)，總黃酮含量最高，達(dá)到175.04 mg/g，高于其它組合。結(jié)果表明：R值由大到小依次為：料液比(D)>提取時(shí)間(A)>提取次數(shù)(C)>提取溫度(B)。其中，影響最大的是料液比，其次是提取時(shí)間、提取次數(shù)和提取溫度。分別計(jì)算出各因素水平對總黃酮含量的平均值K，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，提取時(shí)間(A)、提取溫度(B)和提取次數(shù)(C)中K2值最大，料液比(D)中K3值最大，綜上所述，最適宜的工藝條件為A2B2C2D3，即提取時(shí)間為2 h、提取溫度為50 ℃、提取次數(shù)為2次、料液比為1∶30。

表3 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果

為確定最優(yōu)的提取工藝是否具有穩(wěn)定性，對正交試驗(yàn)中得到最佳提取條件(A2B2C2D3)進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)總黃酮的平均含量為185.74 mg/g，高于正交試驗(yàn)中總黃酮的含量最高的第4組(175.04 mg/g)。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值較小，為0.6%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.5 抗氧化活性研究

在篩選出東北刺人參不定根總黃酮的最佳提取工藝后，試驗(yàn)進(jìn)一步對不定根提取物的抗氧化活性進(jìn)行研究(圖7)。由圖7-A可知, DPPH自由基清除能力隨著提取物濃度升高而升高，在提取物濃度為1 mg/mL時(shí)，自由基清除率達(dá)到了95.56%。而圖7-B表示的是不定根提取物對鐵離子螯和能力的影響，當(dāng)濃度為0～5 mg/mL時(shí)，鐵離子螯和能力與提取物濃度呈正相關(guān),在濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)，鐵離子螯合能力達(dá)到最大值，為75.15%，顯著高于陽性對照檸檬酸(60.12%)。從圖7-C中可以明顯看出，提取物清除ABTS自由基的能力，隨著提取物濃度的提高， ABTS+清除率始終呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)提取物濃度達(dá)到10 mg/mL 時(shí)，ABTS+清除率達(dá)到98.33%，稍低于陽性對照VC(100%)。

3 討論與結(jié)論

近年來，由于對東北刺人參的大量采集,導(dǎo)致其野生資源逐漸稀少,直接影響了東北刺人參的研究與利用。而通過生物反應(yīng)器可以大量培養(yǎng)植物細(xì)胞、組織或器官,目前已應(yīng)用于金線蓮[19]、高山紅景天[20]等多種植物培養(yǎng)中。通過生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東北刺人參不定根具有抗炎、抗癌以及抗氧化等多種功效。其含有的黃酮類化合物具有很好的抗氧化效果，可以清除體內(nèi)自由基，延緩衰老，減少癌癥的發(fā)生, 成為保健品和化妝品的研發(fā)熱點(diǎn)。

現(xiàn)如今,超聲提取法被廣泛應(yīng)用于植物總黃酮的提取。姜守剛等[21]研究了野火球的提取工藝，其最優(yōu)工藝參數(shù)為乙醇濃度50%,超聲時(shí)間75 min,料液比1∶20 (g∶mL),超聲功率350 W。在上述條件下,野火球總黃酮提取率為1.686%。牛明娟等[22]對澤漆黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示:

A ：DPPH自由基自由基清除能力，B：Fe3+螯和能力，C:ABTS+自由基清除能力。

乙醇濃度60%,料液比1∶25(g∶mL),超聲時(shí)間1 h,并且測得黃酮的含量13.71 mg/g. 王飛等[23]對青扦針黃酮提取條件優(yōu)化后的結(jié)果顯示, 青扦針黃酮最佳的提取條件為超聲溫度64.88 ℃、時(shí)間49.46 min、超聲功率319.63 W；此條件下,總黃酮提取率為4.118 69%。

該試驗(yàn)為了篩選東北刺人參不定根總黃酮最佳提取條件，采用超聲提取法優(yōu)化提取工藝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度50%、提取溫度50 ℃、提取2次、料液比1∶30 (g∶mL)條件下，總黃酮含量達(dá)到最高，為185.74 mg/g。在此條件下，試驗(yàn)利用體外抗氧化方法對東北刺人參不定根提取物的抗氧化能力進(jìn)行評估。結(jié)果表明，東北刺人參具有較強(qiáng)的抗氧化活性，最佳條件下的不定根提取物對DPPH和ABTS均有清除能力，其中，對ABTS自由基清除率達(dá)到了98.33%。而隨著提取物濃度的升高，鐵離子螯和能力呈正相關(guān)，當(dāng)達(dá)到一定濃度后，鐵離子螯和能力達(dá)到平穩(wěn)。綜上所述, 東北刺人參不定根可作為抗氧化劑的一種較好的原材料，該研究對東北刺人參資源的開發(fā)及利用提供了良好的理論基礎(chǔ)。