同源盒A9 和前B 細胞白血病同源盒基因在結(jié)腸癌中的表達及意義

王鵬，王勝文，宋曉紅

作者單位：南陽市第一人民醫(yī)院肛腸科，河南 南陽473000

結(jié)腸癌是常見的胃腸道惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3 位，近年來結(jié)腸癌發(fā)生率隨飲食結(jié)構(gòu)、生活習慣變化而增加［1-3］。結(jié)腸癌的發(fā)生是多種癌基因、抑癌基因共同參與調(diào)控的疾病，其病理機制尚未完全闡明。同源盒A9（homeobox gene，HOXA9）是HOX基因A簇中的成員之一，研究顯示其在結(jié)腸癌癌組織中異常表達［4］。前B細胞白血病同源盒基因（Pre-B-cell Leukemia Homeobox Gene 3，PBX3）可以調(diào)節(jié)腫瘤生長增殖等生物學行為，但其在結(jié)腸癌中報道較少，其作用與分子機制尚不清晰［5］。研究顯示，PBX 與HOX 編碼蛋白可相互結(jié)合，促進HOX編碼蛋白與下游靶基因結(jié)合調(diào)控癌癥進程［6］，但二者在結(jié)腸癌中表達關(guān)系研究較少，因此本研究采用免疫組化法檢測HOXA9和PBX3在結(jié)腸癌癌組織及其癌旁組織中的表達情況，分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，同時對二者相關(guān)性進行分析，以期為結(jié)腸癌的診斷與治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2016年5月于南陽市第一人民醫(yī)院進行手術(shù)治療的77 例結(jié)腸癌病人，取其癌組織及相應癌旁組織（其部位與腫瘤邊緣間至少距離2 cm）分別作為結(jié)腸癌組與癌旁組，所有病人均經(jīng)病理證實為結(jié)腸癌。其中男34例，女43 例，年齡范圍為49～70 歲，年齡（59.51±8.17）歲。收集臨床病理資料，按照國際抗癌聯(lián)盟制定的結(jié)腸癌分期標準［4］分為Ⅰ期20 例、Ⅱ期19例、Ⅲ期 19 例、Ⅳ期 19 例；高分化 12 例、中分化 17例、低分化48 例。納入標準：結(jié)腸癌病人均經(jīng)手術(shù)病理證實；術(shù)前未進行化療、放療及激素治療者；病灶無明顯壞死區(qū)。排除標準：臨床資料不完整者；合并自身免疫性疾病者；具有明顯炎癥細胞浸潤癌旁組織；合并其他惡性腫瘤者。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，所有研究對象對本研究知情同意且簽署知情同意書。

1.2 方法 應用TRI 試劑提取結(jié)腸癌組織及其癌旁組織標本中RNA，應用Bio Rad 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用2×SYBR Green PCR MAsterMix，以cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，見表1。PCR 反應條件：95 ℃ 10 min；（95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s）×40 個循環(huán)。采用 2-ΔΔCt算法［7］計算 HOXA9 mRNA、PBX3 mRNA 相對表達量，均以GAPDH 為內(nèi)參基因。試驗重復3次，取平均值。

表1 引物設(shè)計

1.3 免疫組化染色 取凍存的結(jié)腸癌組織及其癌旁組織進行切片，厚度4μm，脫蠟處理后使用3%過氧化氫滅活，切片用PBS溶液洗滌3次，每次5 min，清洗后滴加Ultra V Block，室溫條件下孵育5 min封閉，滴加一抗工作液，4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗，滴加生物素標記的二抗工作液，37 ℃孵育30 min 后經(jīng)DAB 顯色劑顯色，蒸餾水充分沖洗后蘇木素復染，并將其在不同梯度乙醇中脫水、封片。在400 倍光鏡下觀察結(jié)果并從每個切片中選取10 個高倍視野中隨機挑選并對陽性染色細胞數(shù)量進行統(tǒng)計。觀察記錄指標并采用半定量積分法判定結(jié)果：陽性細胞百分比與染色程度。按照染色程度：無色0分；淡黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分，按照陽性細胞占同類觀察細胞總數(shù)的百分比：＜5%記為0 分；5%～25%記為1 分；26%～50%記為2 分；＞50%記為3分。取兩組積分之乘積：≤2分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用統(tǒng)計學軟件SPSS17.0 對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用例（%）表示，采用χ2檢驗；采用Spearman 法進行相關(guān)性分析。各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織及其癌旁組織中HOXA9 mRNA、PBX3 mRNA 表達情況 與癌旁組相比，結(jié)腸癌組HOXA9 mRNA、PBX3 mRNA 表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 結(jié)腸癌77例癌組織及癌旁組織HOXA9 mRNA、PBX3 mRNA表達水平的檢測結(jié)果

2.2 結(jié)腸癌組織及其癌旁組織中HOXA9、PBX3蛋白表達情況 免疫組化結(jié)果顯示HOXA9 位于細胞質(zhì)中，染色呈淺黃色、棕黃色顆粒。PBX3位于細胞質(zhì)及細胞膜中，染色呈淺黃色、棕黃色顆粒。見圖1。與癌旁組相比，結(jié)腸癌組HOXA9、PBX3 蛋白陽性表達率均顯著升高（P＜0.05）。見表3。

表3 結(jié)腸癌組織及癌旁組織中HOXA9、PBX3蛋白表達（n=77）

2.3 HOXA9、PBX3蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)HOXA9表達情況分為HOXA9陰性26例，陽性51例，根據(jù)PBX3表達情況分為PBX3陰性22例，PBX3陽性55例。分化程度低、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期病人HOXA9陽性表達、PBX3陽性表達比例均顯著高于分化程度中高、TNM分期Ⅰ～Ⅱ（P＜0.05），在不同性別、年齡、腫瘤部位、結(jié)腸癌類型、腫瘤大小病人中比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 結(jié)腸癌77例HOXA9、PBX3表達與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系/例

2.4 結(jié)腸癌組織中HOXA9、PBX3 表達關(guān)系HOXA9、PBX3 在結(jié)腸癌組織中同陽性表達率為61.03%（47/77），同陰性表達率為23.38%（18/77）。Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中HOXA9 與 PBX3 表 達 呈 正 相 關(guān)（rs＝0.643，P＜0.05）。見表5。

圖2 結(jié)腸癌77例生存曲線圖：A為HOXA9，B為PBX3

表5 結(jié)腸癌組織中HOXA9、PBX3表達關(guān)系/例

2.5 結(jié)腸癌組織中HOXA9、PBX3蛋白表達與預后的關(guān)系 Kaplan-Meier法分析顯示HOXA9陽性表達組3年內(nèi)總生存率（Overall survival，OS）顯著低于陰性表達組（41.2% 比 84.6%）（χ2＝40.358，P＝0.000）。PBX3陽性表達組病人3年內(nèi)OS顯著低于陰性病人（43.6% 比 86.4%）（χ2＝40.260，P＝0.000）。見圖2。

3 討論

結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，好發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交界處，對人類生命健康具有極大威脅。早期癥狀不明顯，中期也僅表現(xiàn)為腹脹、消化不良，待發(fā)生腹痛、黏液便時已為中晚期，且伴隨病灶轉(zhuǎn)移，貽誤最佳治療時期，因此提高結(jié)腸癌早期診斷率、尋找新的分子靶向治療及轉(zhuǎn)移、復發(fā)預警指標等成為結(jié)腸癌研究中需解決的重大問題。

結(jié)腸癌是多基因參與的過程，目前已發(fā)現(xiàn)多種促癌、抑癌基因參與結(jié)腸癌的癌變進程。研究顯示，HOXA9在結(jié)腸癌中異常表達，HOX 基因在調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖與分化中發(fā)揮重要作用［4］。HOXA9 位于人類7p15-p14，是同源盒 HOX 基因A簇中一員，在控制細胞增殖、分化以及疾病進展中發(fā)揮重要作用［7］。Bhatlekar 等［8］研究表明，HOXA9在結(jié)腸癌組織中呈上調(diào)表達。本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織HOXA9 mRNA 表達水平顯著高于其癌旁組織，同時免疫組化法顯示結(jié)腸癌組織HOXA9 蛋白陽性率顯著高于其癌旁組織，基因、蛋白水平均顯示結(jié)腸癌中HOXA9 表達水平上調(diào)，提示HOXA9 可能與結(jié)腸癌的發(fā)病有關(guān)，是潛在的促腫瘤因子。進一步研究顯示HOXA9 與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織分化程度、浸潤深度顯著相關(guān)，提示HOXA9 可能促進結(jié)腸癌惡性轉(zhuǎn)變過程，與Bhatlekar 等研究一致。同時本研究結(jié)果顯示HOXA9 陽性表達組3年內(nèi)OS 顯著低于陰性表達組，提示HOXA9陽性表達不利于結(jié)腸癌病人預后，為結(jié)腸癌病人術(shù)后隨訪提供了觀測指標。

PBX3是同源盒PBX基因家族成員，編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄因子PBX3，在多種組織中廣泛表達，在多種惡性腫瘤中均高水平表達，如胃癌、宮頸癌以及子宮內(nèi)膜癌［9-12］。研究表明轉(zhuǎn)錄因子PBX3可誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，正常生理狀態(tài)下PBX3處于“沉默”狀態(tài)，當發(fā)生癌癥時被激活［13］。Han等［14］研究表明，結(jié)直腸癌組織中PBX3表達高于正常結(jié)直腸組織，且其表達與結(jié)直腸癌病人預后相關(guān)。PBX3 的高表達導致E-cadherin 介導的細胞黏附丟失、誘導間充質(zhì)標志物活化，增強腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，促進結(jié)直腸癌的浸潤與轉(zhuǎn)移［15］。本研究qRT-PCR 與免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織PBX3 mRNA、蛋白陽性表達率顯著高于其癌旁組織，與臨床病理參數(shù)的關(guān)系研究表明，PBX3與結(jié)腸癌臨床分期、分化程度均顯著相關(guān)，提示PBX3可能促進結(jié)腸癌的進展過程。Lamprecht 等［16］通過細胞學研究證實，PBX3 在具有低分化結(jié)直腸癌細胞株中高表達，而在人結(jié)腸癌高分化細胞株中表達水平則較低，提示PBX3可能與細胞的分化程度及轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。與此一致，本研究也發(fā)現(xiàn)低分化結(jié)腸癌組織中PBX3蛋白陽性表達率顯著高于中高分化癌組織。本研究還顯示PBX3陽性表達組病人3年內(nèi)OS顯著低于陰性病人，提示PBX3陽性表達與結(jié)腸癌病人的不良預后密切相關(guān)，需加強術(shù)后隨訪，并采取方案改善病人預后，延長生命。研究表明，PBX基因編碼的蛋白與HOX基因編碼的蛋白可相互結(jié)合，增強HOX蛋白與DNA的結(jié)合能力，促進下游分子轉(zhuǎn)錄激活，進而促進腫瘤的發(fā)展［17］。本研究 Spearman 分析表明 HOXA9、PBX3蛋白表達在結(jié)腸癌組織中正相關(guān)，二者又均與結(jié)腸癌臨床病理特征密切相關(guān)，推測結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展可能涉及HOXA9、PBX3共同作用，但二者之間的相互作用還有待進一步研究。

圖1 免疫組化法檢測HOXA9、PBX3蛋白表達情況（SP，×400）：A為癌旁正常組織HOXA9蛋白表達，B為結(jié)腸癌組織HOXA9蛋白表達，C為癌旁正常組織PBX3蛋白表達，D為結(jié)腸癌組織PBX3蛋白表達

綜上所述，結(jié)腸癌組織中HOXA9、PBX3蛋白高表達，兩者均與結(jié)腸癌臨床病理特征及預后相關(guān)，可能共同參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究存在一定不足之處，研究樣本較少可能會對結(jié)果造成偏倚，將擴大樣本量，另外對HOXA9、PBX3 共同參與結(jié)腸癌的關(guān)系也有待進一步研究。