腎茶黃酮通過ERK/CT-1通路治療急性腎衰模型鼠氧化應激的實驗研究

郭銀雪 葛平玉 胡茂蓉

摘要 目的：觀察腎茶黃酮對急性腎衰（Acute Renal Failure，ARF）模型鼠氧化應激水平的干預效應，同時觀察其對ERK/CT-1通路的影響。方法：將36只急性腎衰模型大鼠隨機分為模型組和腎茶黃酮觀察組，每組18只，另設假手術組18只。連續(xù)腎茶黃酮干預7 d后比較各組大鼠肝腎功能、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性、腎組織ERK、p-ERK、CT-1水平的變化。結果：腎茶黃酮可明顯降低ARF模型鼠腎質量、腎質量/體質量，改善大鼠肝大和鼠蛋白尿、血漿肌酐、尿素氮水平，減少MDA含量，上調SOD活性，增加腎組織p-ERK、CT-1水平。結論：腎茶對急性腎衰有明顯治療作用，可能通過ERK/CT-1通路介導腎保護效應。

關鍵詞 急性腎衰;模型鼠;氧化應激;MDA;SOD;ERK;CT-1

Abstract Objective：To observe the intervention effects of kidney tea flavonoids on oxidative stress in rats with acute renal failure（ARF）and its effect on ERK/CT-1 pathway.Methods：A total of 36 rats with acute renal failure were randomly divided into a model group（n=18），and a kidney tea flavonoid treatment group（n=18）and a sham operation group（n=18）.The changes of liver and kidney function，malondialdehyde（MDA）content，superoxide dismutase（SOD）activity，renal tissue ERK，p-ERK and CT-1 levels were compared after continuous kidney tea flavonoids intervention for 7 days.Results：Kidney tea flavonoids could significantly reduce the kidney weight and kidney weight/body weight of ARF model rats，improve the levels of proteinuria，plasma creatinine and urea nitrogen，reduce the content of MDA，increase the activity of SOD and increase the levels of p-ERK and CT-1 in renal tissue.Conclusion：Kidney tea has obvious therapeutic effects on acute renal failure，which may be mediated by ERK/CT-1 pathway.

Keywords Acute renal failure; Model mice; Oxidative stress; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; ERK; CT-1

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.006

急性腎衰竭（Acute Renal Failure，ARF）是臨床常見疾病，腎小管上皮細胞由于各種原因引起細胞的缺失或死亡是導致ARF發(fā)生的重要原因[1-2]。有研究顯示在缺血缺氧狀態(tài)下腎臟組織會產(chǎn)生過量的氧自由基，不但會導致酶活性蛋白質的功能受損，而且還可攻擊核基因轉錄過程影響細胞表型，導致腎臟細胞發(fā)生過度凋亡而影響腎功能[3-4]。因此我們推斷，某種干預措施如果可改善氧化應激狀態(tài)，則可減輕ARF腎損害。有研究顯示ERK/CT-1通路與機體氧化應激狀態(tài)密切相關，激活該通路活性可緩解氧化應激引起的細胞凋亡。

腎茶又名貓須草，腎茶黃酮為中藥腎茶的主要提取物，味苦、涼。目前大量研究資料[5-7]均證實腎茶黃酮可明顯增加腎小球數(shù)量，改善腎小管組織形態(tài)，減輕ARF的腎損害程度，但其作用機制目前尚無統(tǒng)一定論，因此我們進行動物模型實驗，以期進一步探討腎茶改善ARF的作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 66只雄性清潔級級Sprague Dawley（SD）大鼠，體質量（220±109）g，鼠齡（58±2）d。所有大鼠貴陽醫(yī)學院提供實驗動物中心提供，所有大鼠均接受同批次標準飼料喂養(yǎng)，實驗均在每日上午8：00-11：30時間段進行，保持環(huán)境安靜、通風，溫度（22±2）℃，相對濕度（55±2）%。各組大鼠在體質量、鼠齡等方面經(jīng)統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 藥物 腎茶，又名貓須草，樣本購自衡陽森本生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司（注冊號：430400000079085，批號：892834），總黃酮由貴陽中醫(yī)學院按照標準進行提取。提取方法：取10 g腎茶，加入100 mL飲用水后置于微波爐內加熱至徹底沸騰后進行循環(huán)提取120 min，充分過濾后收集藥液，隨后加80 mL于藥渣中，再次置于微波爐內加熱至徹底沸騰后進行循環(huán)提取120 min，充分過濾后收集藥液，后將2次提取的藥液濃縮至浸膏[1.26～1.45（70 ℃）]，后將浸膏烘干、打磨成細粉，最終形成腎茶提取物（濃度為每1 g腎茶提取物相當于4.7 g生藥），密封儲存。

1.1.3 試劑與儀器 ERK一抗抗體（CST公司，美國，貨號：4695T）、p-ERK（CST公司，美國，貨號：4370T）、β-actin一抗（CST公司，美國，貨號：3700T）、MDA ELISA試劑盒（上?？泼羯锟萍加邢薰荆浱枺篕B2925）、SOD ELISA試劑盒（上海科敏生物科技有限公司，貨號：E-EL-R0929）。渦旋振蕩儀（上海珂淮儀器有限公司，型號：M392）;蛋白電泳及轉膜系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：B7483）;臺式高速離心機（Eppendorf，德國，型號：5430）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 分組：健康生長1周后，將實驗動物隨機分為假手術組，模型組和腎茶黃酮觀察組，每組18只。造模方法：術前禁食6 h并稱重，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠（0.4 mL/100 g）后，使大鼠仰臥位固定于手術臺上，腹部備皮后以碘伏消毒液局部消毒，暴露手術區(qū)域。沿腹正中線縱行切口打開腹腔，用生理鹽水浸濕的無菌紗布牽開腹腔臟器，先暴露右腎，以1號泰絲線分別結扎整個腎蒂和右輸尿管并切除右腎;游離左腎，用無創(chuàng)傷動脈夾夾閉左腎動脈，并開始計時，觀察左腎顏色：由紅潤變?yōu)樯n白表示夾閉有效。1 h后松夾恢復左腎灌注，此時腎臟顏色恢復紅潤，提示再灌注成功。觀察術野無出血和滲血后逐層縫合關閉腹腔，用碘伏消毒液再次消毒傷口后肌肉注射青霉素（6萬U/100 g）2 d。假手術組僅切除右側腎臟后關腹。

1.2.2 給藥方法 腎茶黃酮組于再灌注24 h后開始腹腔注射腎茶黃酮配比液2 mL（用0.9%生理鹽水稀釋，生藥量為0.1 g/1 mL），2次/d?？瞻捉M及模型組大鼠接受2 mL生理鹽水干預。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 肝、腎功能檢測 干預結束后隨機選取3只/組大鼠，心臟采血4 mL，注入10 mL離心管中，予低速離心機（3 000 r/min）中，離心半徑5 cm，離心10 min分離血清，低溫保存，全自動生化儀及時檢測。

1.2.3.2 用免疫組化法測定各組腎組織CT-1水平變化 常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗大鼠CT-1抗體（1∶50稀釋），二抗為生物素化羊抗兔IgG（1∶100稀釋），以PBS代替一抗作陰性對照，DAB顯色，胞質呈棕黃色或棕褐色顆粒的細胞為陽性表達細胞，光鏡觀察陽性信號。應用圖文分析報告系統(tǒng)在大鼠病變區(qū)域隨機采集10個視野（×200倍），每個視野計數(shù)100個細胞，總計1 000個細胞，計算出平均陽性率，以百分率（100%）表示陽性細胞數(shù)，即得。

1.2.3.3 用ELISA檢測法測定各組外周血MAD、SOD水平變化 于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，取其腹主動脈血5 mL，高速離心后取出上清液，用相應的ELISA試劑盒對各組細胞的MAD、SOD水平進行檢測，具體步驟如下：將樣本加入ELISA反應孔板中，4 ℃過夜。第2天棄去孔內溶液，加入PBS洗滌2次，3 min/次，同時設置空白對照孔，再加入的酶標抗體的酶標抗體，室溫下孵育1 h后加入PBS洗滌2次，3 min/次。反應結束后先后于空中加入0.1 mL的TMB及0.05 mL的2M硫酸，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔的吸光值（OD值）。操作過程完全按照說明書進行。

1.2.3.4 用Western Blot測定各組中腎臟組織ERK、p-ERK水平變化 于最后1 d干預結束后每組隨機抓取3只大鼠，充分麻醉后處死，取中縫背核組織200 mg加1 mL裂解緩沖液，4 ℃，15 000 r/min，離心5 min，離心半徑10 cm，冰浴中超聲，20 s/次，間隔20 s，共5次，1 h取上清，取25 μL測蛋白含量。BCA法測蛋白濃度，用凝膠加樣緩沖液將各管蛋白濃度調為一致（2 mg/mL），取20 μL樣品煮沸5 min。電泳（5%濃縮膠，12%分離膠，60 V，40 mA，2.5 h）結束后將凝膠取出，進行轉膜，遵循膠在負極，膜在正極的原則，100 V，250 mA，時間依據(jù)各指標分子量大小而定，將硝酸纖維素膜取出，用麗春紅對固定于硝酸纖維素濾膜上的蛋白質進行預染，看電泳帶是否清晰，證實蛋白質確實轉移到膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗3次，5 min/d，分別加入抗ERK、p-ERK、β-actin一抗抗體孵育，4 ℃過夜TBST洗2次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記與一抗相抗的二抗IgG（1∶2 000）室溫50 min，TBST洗3次，5 min/次。將濾膜放人配好的顯色液中反應1 min，計算機掃描圖像，并由生物圖像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：Model Gel Doc 2000）分析處理。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料用百分比（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎質量、腎質量/體質量的變化比較與假手術組比較，造模組大鼠腎質量、腎質量/體質量均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，腎茶黃酮觀察組腎質量、腎質量/體質量均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠蛋白尿、腎功能變化比較 對各組大鼠24 h蛋白尿及腎功能指標進行檢測，結果顯示接受ARF模型制備的大鼠蛋白尿、血漿肌酐、尿素氮水平明顯增加，與假手術組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)腎茶黃酮治療后大鼠蛋白尿、血清肌酸酐和尿素氮含量顯著減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠血脂水平變化比較 與假手術組比較，經(jīng)過ARF模型制備后大鼠血漿總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），與模型組比較，腎茶黃酮觀察組上述指標均明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠氧化應激水平變化比較 與假手術組比較，經(jīng)過ARF模型制備后大鼠SOD活性明顯下降，MDA含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)過腎茶黃酮治療后大鼠SOD水平上調，MDA表達下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠中腎臟組織ERK、p-ERK、CT-1水平變化比較 經(jīng)過Western Blot檢測可知各組大鼠腎臟組織ERK/β-actin比值相仿，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），與假手術組比較，經(jīng)過ARF模型制備后大鼠腎臟組織p-ERK、CT-1水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），經(jīng)過腎茶黃酮治療后大鼠p-ERK、CT-1表達上調，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1、圖2、表5。

3 討論

ARF是目前備受關注的公共健康問題，一旦ARF控制不理想將出現(xiàn)病情急速惡化，甚至引發(fā)其他系統(tǒng)的嚴重并發(fā)癥。腎切除是目前較為符合人類ARF病理變化的動物模型，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)造模大鼠的腎臟在術后明顯增大，這可能與腎臟組織缺血缺氧后腎小管上皮細胞變性壞死，導致其基底膜連續(xù)性受破壞，產(chǎn)生斷裂，由此腎小管內液反流至間質，從而出現(xiàn)腎間質性水腫，從而引起腎臟體積變大[8-9]。氧化應激是CRF的已知特征，其中SOD及MDA是目前最具代表機體氧化應激水平的指標。SOD廣泛分布于生物體內，其中腎臟尤為凸顯，是清除氧自由基的主要酶類物質。MDA是脂質過氧化作用后的產(chǎn)物，其水平高低直接標志機體氧自由基水平。大量動物模型實驗證實，SOD及MDA和ARF疾病發(fā)生發(fā)展關系密切，過度表達的氧自由基通過脂質過氧化作用對腎小球產(chǎn)生損害作用，而脂質過氧化作用又是激活纖維細胞產(chǎn)生膠質的生物過程，從而導致機體腎小球系膜區(qū)的膠原分泌增多致沉積，導致腎間質纖維化產(chǎn)生，破壞了腎組織的正常結構及形態(tài)，影響了腎功能的正常運行。腎臟局部組織中固有細胞及浸潤細胞分泌過量的氧自由基，且抗氧化酶如SOD濃度下調，從而出現(xiàn)氧自由基與抗氧化物酶之間的動態(tài)平衡受破壞，從而逐漸產(chǎn)生了上述ARF的病理改變，因此調節(jié)氧自由基在腎組織局部的生成及消除平衡是治療ARF的關鍵[10-12]。

腎茶乃貓須草之別稱，藥理學分析證實其含有迷迭香酸、迷迭香酸乙酯、熊果酸等化學成分[13-15]。中醫(yī)角度認為腎茶味苦性含寒涼，是清熱解毒、利尿止血之良品，現(xiàn)代藥理學亦證實其有明顯改善腎功能的作用。BUN和Scr是臨床廣泛應用于衡量腎功能的重要指標，BUN主要由肝臟合成，腎臟排泄，與腎小球濾過率密切相關;血漿Scr由肌組織中磷酸肌酸分解產(chǎn)生，亦由腎臟排泄，在一定程度上亦體現(xiàn)了腎小球濾過率，故BUN及Scr均是間接體現(xiàn)腎臟損傷程度的重要因子。本研究通過動物模型證實腎茶確可明顯減少蛋白尿的釋放，降低BUN及Scr的水平，這充分說明腎茶可明顯改善腎功能，與國內外諸多文獻結果一致[16-18]。

有研究顯示在缺血缺氧狀態(tài)下腎臟組織產(chǎn)生大量的氧自由基會攻擊腎臟組織細胞的脂質、DNA遺傳物質以及蛋白質等大分子，從而導致腎臟組織細胞過度凋亡。有資料[19]顯示在機體缺血缺氧狀態(tài)時CT-1可發(fā)揮反饋性保護效應，一旦ERK/CT-1通路被抑制則導致機體對抗氧化性損害的能力減弱，導致細胞過度凋亡，影響細胞活性。本研究顯示造模大鼠的腎臟組織的ERK/CT-1通路標志性因子的表達被抑制，經(jīng)過腎茶干預后大鼠的p-ERK及CT-1表達均上調，因此我們有理由相信腎茶可通過激活ERK/CT-1通路而實現(xiàn)保護ARF機體的腎功能。

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（2019-10-10收稿 責任編輯：王楊）