基于UPLC-MS/MS大鼠體內(nèi)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的藥代動力學參數(shù)研究*

許玲玲，姚兆敏，汪電雷，周媛媛，張 敏，李晨輝，仰忠華，趙亞男,3△

（1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院， 安徽 合肥 230012；2.安徽仙寓山農(nóng)業(yè)科技有限公司，安徽 黃山 245000；3.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院，安徽 蕪湖 241001）

白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.），菊科多年生草本植物，根莖入藥，主產(chǎn)于浙江、江西、湖南、安徽等地，有於術(shù)、浙東術(shù)、江西術(shù)、平江術(shù)、祁術(shù)之稱[1]，多以產(chǎn)地命名。性溫，味苦、甘，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、利水祛濕的功效[2]。白術(shù)中主要化學成分為倍半萜類、多炔類、多糖等，其中倍半萜類中白術(shù)內(nèi)酯類具有顯著的抗腫瘤[3]、抗炎[4-5]和神經(jīng)保護作用[6]。白術(shù)內(nèi)酯I可劑量依賴性地抑制NO、TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，對慢性炎癥有較強的抑制作用[2]。白術(shù)內(nèi)酯II和III能夠增強唾液淀粉酶活性和改善胃腸道運動功能[7-8]，具有健脾和調(diào)節(jié)紊亂腸道菌群的作用，符合臨床應用白術(shù)健脾的藥理活性機制。

白術(shù)內(nèi)酯I、II、III是白術(shù)化學成分與藥效密切相關的指標性成分，為了研究白術(shù)內(nèi)酯類化合物的藥理活性機制，本文就文獻報道的方法進行改進[9-14]，采用UPLC-MS/MS法同時檢測白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的含量，考察其在大鼠體內(nèi)的藥動學變化趨勢，旨在為其體內(nèi)藥物代謝動力學過程提供初步參考，以期為白術(shù)的臨床合理應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 白術(shù)（Atractylodes macrocephala Koidz.），產(chǎn)于安徽祁門，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學生藥系金傳山教授鑒定為菊科白術(shù)的干燥塊莖。藥材前處理：白術(shù)，除去表面污泥，曬干，并清理多余的須根。置于35℃恒溫干燥箱中干燥48 h，切片，打粉過3號篩，備用。取白術(shù)粉末300 g，加入3 000 mL蒸餾水，先浸泡30 min，保持微沸30 min，藥液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，T=60℃，n=40 r/min，濃縮至一定體積，得到濃度為 0.84 g/mL的白術(shù)藥材提取物。白術(shù)內(nèi)酯I、II、III（武漢中標科技有限公司，批號分別為：73069-13-3、73069-14-4、73030-71-4，純度：≥98%）；對乙酰氨基酚（中國藥品生物制品檢定所，批號：100018-200408，純度 ≥ 98%）；乙腈、甲醇（色譜純）；超純水（自制）；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量（180±20）g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，合格證號：SCXK（皖）2019-002。實驗前大鼠適應性飼養(yǎng)1周，標準溫度（25±2）℃，相對濕度 40%～55%，自由攝食攝水。給藥前禁食12 h，自由飲水。本文涉及的動物實驗經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準。

1.3 儀器 Acquity UPLC超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Xevo G2QTOF質(zhì)譜儀（美國 Waters公司）；A2004型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；Milli-Q Gradient A10超純水器（Millipore Inc.USA）；Centrifuge 5804R臺式高速離心機（上海東兢電子有限公司）；HK-2016切片機（湖北海闊醫(yī)療科技有限公司）；LK-400B型打粉機（浙江溫嶺創(chuàng)新藥材器械廠）；202-2型電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器有限公司）；AS5150A型超聲清洗儀（Autoscience公司）；YRE201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏予予華儀器有限公司）。

表1 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的結(jié)構(gòu)式

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 Waters ACQUITY UPLC CSH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：25 ℃；進樣量：2 μL；體積流量：0.2 mL/min；運行時間：55 min；檢測波長：240 nm。流動相：0.05%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～19 min，25%～54%B；19～30 min，54%～56%B；30～40 min，56%B；40～50 min，56%～65%B；50～60 min，65%～25%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜離子源為電噴霧離子化源正離子（ESI+），選擇多反應監(jiān)測（MRM）模式，高純氮氣作為質(zhì)譜用氣，用于定量反應的離子和能量分別為：白術(shù)內(nèi)酯 I（m/z 233.1→215.1），去簇電壓 96.1 V、射入電壓10.4 V、碰撞電壓18.6 V、碰撞室射出電壓11.0 V；白術(shù)內(nèi)酯II（m/z 231.0→185.0），去簇電壓103.4 V、射入電壓10.0 V、碰撞電壓26.8 eV、碰撞室射出電壓 13.1 V；白術(shù)內(nèi)酯 III（m/z 249.1→231.0），去簇電壓80.0 V、射入電壓10.4 V、碰撞電壓13.9 eV、碰撞室射出電壓16.0 V；對乙酰氨基酚（m/z 152.1→109.8），去簇電壓 65 V、射入電壓 10.4 V、碰撞電壓20.7 eV、碰撞室射出電壓11.0 V。氣簾氣10.0 Psi；碰撞氣 9 Psi；噴霧電壓 5 500 V；霧化溫度550 ℃；霧化氣 11.0 Psi；輔助氣 0.0 Psi。

1.4.3 標準與質(zhì)控樣品的制備 精密稱取白術(shù)內(nèi)酯I、II、III對照品和對乙酰氨基酚（內(nèi)標）各 1.00、1.38、1.41、1.07 mg，加乙腈溶解并定容至1 mL，得濃度分別為1、1.38、1.41 mg/mL的對照品儲備液和濃度為1.07 mg/mL的內(nèi)標溶液，用乙腈梯度稀釋白術(shù)內(nèi)酯I、II、III儲備液得白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III對照品工作液，稀釋內(nèi)標儲備液至10 ng/mL作為內(nèi)標工作液，-4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

建立標準曲線的質(zhì)控樣品：50 μL空白血漿，加入25 μL內(nèi)標與一定體積的對照品工作液，按下列濃度制備標準曲線：白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III分別為 1.25、2.5、5、10、30、100 ng/mL；1.725、3.45、6.9、13.8、41.4、138 ng/mL；1.765、3.53、7.06、14.12、42.3、141 ng/mL；內(nèi)標溶液為10 ng/mL?？瞻籽獫{中質(zhì)控樣品的濃度為：白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III 分 別為 2.5、10、100 ng/mL；3.45、13.8、138 ng/mL；3.53、14.12、141 ng/mL。

1.4.4 血漿樣品預處理 取血漿樣品50 μL，加入內(nèi)標（10 ng/mL，25 μL）；渦旋混合 30 s，加入 1 mL 乙酸乙酯萃取，渦旋混合3 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液50 μL至新的EP管中，于35℃下N2流吹干，殘渣用100 μL乙腈復溶，渦旋混合30 s，10 000 r/min離心10 min，取上清液，進樣2 μL進行UPLC-MS/MS定量分析。

1.4.5 動物分組與給藥 18只大鼠，灌胃給藥前禁食不禁水12 h，每組6只。低、中、高劑量組分別為2.1、4.2、8.4 g/kg，一次性灌胃給藥。分別于灌胃給藥后的 0.083、0.17、0.25、0.33、0.5、1、2、4、6 和 12 h，眼底靜脈叢采血 0.3 mL/次；采后的血漿經(jīng)3 500 r/min，4℃，離心10 min，吸取上清液，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆?。血漿樣品按“1.4.4”項下操作后進樣分析，得到各個時間點的白術(shù)內(nèi)酯I、II、III與內(nèi)標的峰面積。

1.5 數(shù)據(jù)處理 使用LabSolutions軟件進行數(shù)據(jù)采集和處理，求得血漿校正曲線并且計算每只動物的白術(shù)內(nèi)酯I、II、III濃度數(shù)據(jù)；血漿藥物濃度數(shù)據(jù)應用DAS 2.1藥代動力學軟件擬合，計算藥代參數(shù) tmax、t1/2、Cmax、AUC0-t。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)譜分析 待測物白術(shù)內(nèi)酯I、II、III及內(nèi)標在ESI源正離子條件下信號強度優(yōu)于負離子條件。一級全掃描模式下，待測物白術(shù)內(nèi)酯I、II、III及內(nèi)標分別主要生成準分子離子[M+H]+m/z 232.9、231.1、248.9、151.9。對相應的準分子離子進行二級質(zhì)譜全掃描分析，待測物白術(shù)內(nèi)酯I、II、III及內(nèi)標進一步優(yōu)化后分別選取 m/z 215.1、185.0、231.0、109.8 二級離子作為定量分析時檢測的產(chǎn)物離子。

2.2 方法專屬性 取大鼠的空白血漿，每個平行6份，除不加內(nèi)標溶液外，其余按“1.4.4”項下操作，對本方法學的專屬性進行考察，內(nèi)源性物質(zhì)不會對分析物白術(shù)內(nèi)酯I、II、III及內(nèi)標產(chǎn)生信號干擾。白術(shù)內(nèi)酯I、II、III 及內(nèi)標的保留時間分別為：2.55、3.1、1.8、1.2 min，見圖 1。

2.3 標準曲線與靈敏性 樣品經(jīng)過預處理后，使用對照品建立標準曲線。取空白血漿，每個平行操作6份，分別加入白術(shù)內(nèi)酯I、II、III和內(nèi)標對照品工作液適量，依次測得白術(shù)內(nèi)酯I、II、III和內(nèi)標的峰面積，以進樣濃度（X）為橫坐標，峰面積比值（Y）為縱坐標，最小二乘法計算回歸方程。測得回歸方程為最后建立的標準曲線：白術(shù)內(nèi)酯I：Y=1.447X-2.9396，r=0.9972；白術(shù)內(nèi)酯 II：Y=0.9918X-3.5478，r=0.9936；白術(shù)內(nèi)酯 III：Y=0.4699X-0.3463，r=0.9933；r值均大于 0.99以上，說明白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III分別在 0.1～100 ng/mL、0.138～138 ng/mL、0.141～141 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的定量下限分別為 1.25、1.725、1.765 ng/L（S/N=10）。白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III的檢測限分別為 0.1、0.138、0.141 ng/L（S/N=3）。

2.4 準確度與精密度 取低、中、高3個不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的質(zhì)控樣品，每個濃度平行6次，連續(xù)進行3天，于日內(nèi)和日間各測定6次，分別計算日內(nèi)與日間精密度（RSD）與準確度（RE）。準確度在95%以上，日內(nèi)和日間精密度均小于10%，均符合檢測要求，見表2。

表2 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的日內(nèi)與日間準確度與精密度（n=6）

2.5 基質(zhì)效應 取空白血漿，按“1.4.4”項下處理后，加入低、中、高3個不同濃度的對照品系列的工作液，N2流吹干后，乙腈復溶，每個濃度進樣6次，記錄峰面積A；另取低、中、高3個不同濃度的對照品系列工作液，N2流吹干后，乙腈復溶，每個濃度進樣6次，記錄峰面積B；基質(zhì)效應的RSD在10%以下，表明不會對樣品的分析產(chǎn)生明顯影響，見表3。

表3 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的基質(zhì)效應（n=6）

2.6 提取回收率 取空白血漿，按“1.4.4”項下處理后，加入低、中、高3個不同濃度的對照品系列工作液，于35℃下N2流吹干，以100 μL乙腈復溶，每個濃度進樣6次，記錄峰面積A；另取空白血漿，加入低、中、高3個不同濃度的對照品系列工作液，同樣按“1.4.4”項下處理后，于35℃下N2流吹干，以100 μL乙腈復溶，每個濃度進樣6次，獲得相應峰面積值B，計算提取回收率A/B（%），見表4。

表4 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的提取回收率（n=6）

2.7 穩(wěn)定性 配制低、中、高3個不同濃度的質(zhì)控樣品，于-20℃冰箱中冷凍1周，室溫下解凍后，立即按“1.4.4”項下處理樣品后，進樣分析，如此重復3次冷凍與解凍過程，考察樣品的3次凍融循環(huán)穩(wěn)定性。24 h內(nèi)重復分析低、中、高3個不同濃度的質(zhì)控樣品，考察樣品在進樣瓶內(nèi)的短期穩(wěn)定性。將配制好的標準樣品于 -20℃冰箱中貯存，在第30天取出測定，與樣品配制當天所測得的濃度比較，考察樣品的長期穩(wěn)定性，見表5。

表5 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的穩(wěn)定性（n=6）

圖1 大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、II、III+內(nèi)標的色譜圖

2.8 藥動學結(jié)果 白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。白術(shù)內(nèi)酯I、II、III入血吸收較快，在0.0833 h即可檢測到，在血漿中可以持續(xù)12 h左右；白術(shù)內(nèi)酯I、II成分的首次達峰時間點接近，都在0.5 h左右，白術(shù)內(nèi)酯III成分達峰時間在1 h。

比較表6-1、6-2、6-3發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的增加，大鼠體內(nèi)血漿中白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的達峰濃度逐漸增加，由圖3可以看出白術(shù)內(nèi)酯I、II、III在大鼠體內(nèi)的AUC0-t和劑量呈正相關。

圖2 大鼠體內(nèi)白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的藥-時曲線

表6-1 低劑量組白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的藥代動力學參數(shù)（n=6）

表6-2 中劑量組白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的藥代動力學參數(shù)（n=6）

表6-3 高劑量組白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的藥代動力學參數(shù)（n=6）

圖3 大鼠體內(nèi)白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的AUC0-t和劑量之間的關系

3 討論

課題組前期已對不同產(chǎn)地的白術(shù)進行指紋圖譜和含量測定[15]，結(jié)合實驗結(jié)果對白術(shù)進行分析，綜合評分發(fā)現(xiàn)祁門產(chǎn)地的白術(shù)質(zhì)量明顯優(yōu)于其它產(chǎn)地。相關文獻報道，白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯類成分具有改善胃腸功能[16]、抗炎[17]和抗腫瘤[18-19]等作用，大劑量白術(shù)水煎劑能促進胃腸運動[20]，而且隨著劑量的增加作用也增強。因此，本研究通過對報道的白術(shù)內(nèi)酯的藥代動力學檢測方法進行改進，建立了一個靈敏、快速、可靠的UPLC-MS/MS法，并驗證了該方法可以定量大鼠血漿中白術(shù)內(nèi)酯 I、II、III的濃度。

在藥代動力學實驗中，對于生物樣品的處理考察了乙腈沉淀蛋白和乙酸乙酯萃取兩種方法，由于白術(shù)入血后的濃度極低，故選擇通過乙酸乙酯萃取后濃縮復溶法處理生物樣品。藥動學實驗結(jié)果可看出，白術(shù)內(nèi)酯在5 min內(nèi)即可檢測到，吸收快、達峰時間長、半衰期長，AUC與劑量呈線性關系，隨劑量的增大而增大。

此課題研究還存在一定的局限性，首先是藥物作用機制不明確，其次是未能將白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的藥代動力學與藥效學相結(jié)合。白術(shù)內(nèi)酯I、II、III的作用機制與發(fā)揮健脾益氣功效的聯(lián)系還需要進一步深入研究。