基于網(wǎng)絡藥理學的熟地黃環(huán)烯醚萜類成分治療類風濕性關(guān)節(jié)炎作用機制的初步探究

張冬麗，于歡，李敏，唐生安

（天津醫(yī)科大學天然藥物學系，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津300070）

類風濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種病因尚未完全闡明的系統(tǒng)性炎癥性自身免疫病，其主要特點是關(guān)節(jié)滑膜炎的產(chǎn)生、血管翳的形成和軟骨破壞?；ぱ壮志梅磸桶l(fā)作，導致關(guān)節(jié)內(nèi)軟骨及骨的破壞，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學藥物治療RA 主要有非甾類抗炎藥，如美洛昔康、塞來昔布；生物制劑，如依那西普、英夫利昔單抗和糖皮質(zhì)激素等，這些藥物雖能緩解RA 病情，但具有一定的毒副作用。中藥具有多成分、多靶點、多途徑的治療特點，一定程度上可以彌補西藥帶來的不良反應，為進一步尋找抗RA 藥物提供新方向。

熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata）為玄參科、地黃屬植物。生地黃甘苦而寒，具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用；而熟地黃甘溫味厚，具有滋陰補血、益精填髓的功效[2]。根據(jù)RA 的證候特點不同，熟地黃多用于治療腎虛寒凝型、氣血虧虛型、寒濕痹阻型RA[3]。研究表明，六味地黃湯可以通過調(diào)節(jié)機體的免疫功能狀態(tài)、恢復免疫平衡實現(xiàn)治療自身免疫性疾病[4]。但由于自身免疫性疾病發(fā)病機制較復雜，熟地黃中有效成分和作用機制并不明確。因此，本文利用網(wǎng)絡藥理學對熟地黃環(huán)烯醚萜類成分進行篩選，預測其作用的與RA 有關(guān)的靶點及相關(guān)通路，構(gòu)建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖，直觀地展示熟地黃環(huán)烯醚萜類成分主要作用的靶點和通路，預測其作用機制。

1 材料與方法

1.1 候選成分的虛擬篩選 首先通過查找文獻得知熟地黃環(huán)烯醚萜類成分有促進骨細胞的增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)的作用[5]，提示熟地黃環(huán)烯醚萜類成分具有抗RA 活性。利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫（TCMSP）檢索熟地黃成分，可以找到26個環(huán)烯醚萜成分，從中篩選出類藥性（DL）≥0.18 且具有較多作用靶點的5個成分，分別為：梓醇（1）、益母草苷（2）、桃葉珊瑚苷（3）、（2S，3R，4R，5S，6R）-2-{[（1S，4aS，5R，7aR）-4a，5-dihydroxy-7-methylol-5，7adihydro-1H-cyclopental9（c）pyran-1-yl]oxy}-6-methylol-tetrahydropyran-3，4，5-triol（4）、京尼平苷（5），結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 熟地黃環(huán)烯醚萜類成分結(jié)構(gòu)Fig 1 The structure of ilidoids from Rehmanniae Radix Praeparata

1.2 候選成分靶點預測 通過PubChem 數(shù)據(jù)庫查找候選成分相關(guān)的分子信息及生物學測試[6]和TCMSP 數(shù)據(jù)庫進而確定各成分潛在的作用靶點。采用UniProt KB 搜索功能得到這些靶蛋白的UniProt ID，基因名稱及其正確名稱。

1.3 靶點的篩選 在治療靶標數(shù)據(jù)庫（TTD）中輸入關(guān)鍵詞“rheumatoid arthritis”，可以得到有關(guān)RA的靶點信息；在DrugBank 數(shù)據(jù)庫中搜索美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的抗RA 藥物的靶點，將兩個數(shù)據(jù)庫得到的與RA 相關(guān)的靶點信息進行整合。預測的候選成分的靶點與RA 相關(guān)靶點進行比對分析，得到靶點中有明顯抗RA 作用的靶蛋白，并統(tǒng)計頻次。

1.4 相關(guān)通路獲取及分析 將比對之后的靶蛋白的UniProt ID 導入生物學信息資源數(shù)據(jù)庫David（https://david.ncifcrf.gov/home.jsp），得到靶點的相關(guān)通路信息后進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析。參數(shù)設置如下：Identifier：UNIPROT_ACCESSION；List Type：Gene List；Species：Homo sapiens（Human）。在分析報告的“Functional Annotation Chart”中通過P 值（P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義）進行篩選。

1.5 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構(gòu)建 以選取的5個成分、比對分析過的靶點和通路建立相互關(guān)系，導入Cytoscape3.7.0 軟件，分析熟地黃環(huán)烯醚萜“成分-靶點-通路”的網(wǎng)絡圖。

2 結(jié)果

2.1 熟地黃環(huán)烯醚萜類成分的潛在靶點信息 將PubChem 數(shù)據(jù)庫中獲得的靶點信息與TTD 數(shù)據(jù)庫和DrugBank 數(shù)據(jù)庫中獲得的與RA 相關(guān)的靶點信息進行比對，得到13個重復靶點，即可能為熟地黃環(huán)烯醚萜類成分治療RA 的潛在作用靶點，見表1。

對比篩選出的各靶點的網(wǎng)絡節(jié)點度（Degree），腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6、NF-κB 抑制蛋白α（IκBα）較高，為網(wǎng)絡中的樞紐節(jié)點，提示它們可能是熟地黃環(huán)烯醚萜類成分抗RA的關(guān)鍵作用靶點。在表1 的基礎(chǔ)上，對5個成分作用的靶點數(shù)進行歸納，見表2。

表2 熟地黃環(huán)烯醚萜成分的潛在靶基因和靶點數(shù)Tab 2 Potential target genes and target number from the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

5種化合物的母核都是環(huán)烯醚萜結(jié)構(gòu)。由表2可知，桃葉珊瑚苷和京尼平苷的靶點數(shù)較多，與其他成分比較，提示桃葉珊瑚苷和京尼平苷具有相對較好抗RA 活性?？梢娛斓攸S環(huán)烯醚萜的不同化學成分不僅可以作用于相同的靶點，也可作用于不同的靶點，體現(xiàn)了其多成分、多靶點的抗RA 機制。

2.2 熟地黃環(huán)烯醚萜成分潛在靶點的生物學過程和通路注釋分析 從13個靶點中篩選出9個靶點(JAK2、IκBα、IL-1β、IL-6、TNF、Bcl-2、TP53、TLR9、PTGS2)進行生物學過程分析和通路注釋分析，得到15 條通路信息及靶點的生物學過程，主要富集在炎癥反應、脂多糖調(diào)節(jié)的信號通路、凋亡過程、IL-6 產(chǎn)生的正向調(diào)控、NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控、NF-κB 導入細胞核的正向調(diào)控、NO 生物合成的正向調(diào)控等生物學過程。其中有5 條通路與RA 直接相關(guān)[7-9]，包括NF-κB 信號通路、TLR 信號通路、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路和細胞凋亡，見表3。

表3 RA 相關(guān)信號通路所包含的靶基因Tab 3 Target genes involved in RA related signaling pathways

根據(jù)表3 可知，5 條通路與免疫調(diào)節(jié)和細胞凋亡相關(guān)，屬于細胞因子和細胞調(diào)節(jié)通路[10]，提示熟地黃環(huán)烯醚萜成分主要通過這兩類通路產(chǎn)生抗RA 活性。

靶點參與的主要通路注釋分析如圖2 所示。

圖2 KEGG 通路富集分析結(jié)果Fig 2 The result of KEGG pathway enrichment analysis

2.3 熟地黃環(huán)烯醚萜“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構(gòu)建 圖中共29個節(jié)點，包括5個成分、9個靶點、15條通路。從圖3 中可以看出，除了2.2 中提到的6條與RA 直接相關(guān)的通路外，還涉及其他通路，比如甲型流感、肺結(jié)核、利什曼病、麻疹、單純皰疹感染、乙型肝炎、非洲錐蟲病等，這些通路與免疫系統(tǒng)、細胞生存與凋亡有關(guān)，從不同角度揭示了熟地黃環(huán)烯醚萜成分具有抗RA 活性的特點[11]。

圖3 熟地黃環(huán)烯醚萜“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖Fig 3 “Components-targets-pathways”network of the iridoid constituents of Rehmanniae Radix Praeparata

3 討論

中醫(yī)藥歷經(jīng)千百年的臨床實踐，積累了豐富的經(jīng)驗。中藥及其方劑具有多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用等特點，在防治復雜疾病方面具有其自身的特色和優(yōu)勢。網(wǎng)絡藥理學是一種系統(tǒng)的方法，它是以“疾病-基因-靶點-藥物”網(wǎng)絡模型的形式發(fā)展起來的，從多維的角度解釋和評價藥物的分子機制。它可以在靶點-通路識別以及說明藥物靶點相互作用等方面發(fā)揮作用，并利用藥物-靶點相互作用網(wǎng)絡闡明藥物的作用機制[12]。因此，在對傳統(tǒng)藥物進行作用機制的研究中，可以利用網(wǎng)絡藥理的方法，對其進行初步探索。

既往研究表明，許多細胞因子是RA 產(chǎn)生炎癥反應和關(guān)節(jié)損傷的重要介質(zhì)，與RA 密切相關(guān)的細胞因子有IL-1、TNF-α、IL-6，而TNF-α 在炎癥反應中是關(guān)鍵的細胞因子，若抑制其產(chǎn)生，則IL-1、IL-6 的產(chǎn)生也會相對減少[13]。NF-κB 是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進其他炎癥因子，如TNF-α、IL-1β 的產(chǎn)生[14]。IκBα 作為NF-κB 抑制劑，可以抑制NF-κB活性，使其在RA 滑膜組織中的含量下降。

Bi 等[15]發(fā)現(xiàn)梓醇在星形膠質(zhì)細胞的炎癥反應中可以抑制PTGS2 的產(chǎn)生，使NF-κB 失活可能是其抗炎機制的主要決定因素。Park[16]研究發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷能夠抑制細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)活性、Iκ-Bα 降解和隨后的NF-κB 活化。Wang 等[17]發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷在大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中可以抑制PTGS2 的產(chǎn)生，并且抑制IL-1β 誘導炎癥反應及軟骨基質(zhì)降解，其作用是通過抑制NF-κB 信號通路活性實現(xiàn)的。Pan 等[18]發(fā)現(xiàn)京尼平苷可以促進經(jīng)IL-1β 刺激的大鼠軟骨細胞中膠原蛋白Ⅱ的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達。

本文以熟地黃環(huán)烯醚萜類的5個成分為研究對象，進行靶點預測，采用網(wǎng)絡構(gòu)建以及通路注釋分析的網(wǎng)絡藥理學方法對熟地黃潛在的抗RA 作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)桃葉珊瑚苷和京尼平苷作用的與RA 相關(guān)的靶點較多，為熟地黃環(huán)烯醚萜類化合物發(fā)揮抗RA 活性的關(guān)鍵成分；TNF、IL-1β、IL-6、IκBα 是關(guān)鍵靶點；由GO 分析和KEGG 通路注釋分析結(jié)果可知，熟地黃環(huán)烯醚萜成分作用的靶點主要通過炎癥反應、凋亡過程、IL-6 產(chǎn)生的正向調(diào)控、NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正向調(diào)控等生物學過程，在NF-κB 信號通路、TLR 信號通路、TNF 信號通路、細胞凋亡中發(fā)揮抗RA 活性。本研究闡明熟地黃環(huán)烯醚萜類化合物抗RA 的“多成分-多靶點-多通路”作用機制特點，為深入研究熟地黃抗RA 的作用機制奠定了基礎(chǔ)。