重組質(zhì)粒pcDNA4-FLAG-GLUT1 構(gòu)建及蛋白表達(dá)

徐子豪，史小雨，王倩

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津300070）

瘧疾是由瘧原蟲(chóng)（plasmodium）感染所引起的寄生蟲(chóng)疾病，通過(guò)雌性按蚊叮咬人體傳播，在全球范圍內(nèi)仍有著較高的發(fā)病率和死亡率[1]。瘧原蟲(chóng)在人體的寄生生活主要分為肝細(xì)胞期和紅細(xì)胞期，其中以紅細(xì)胞期引起的臨床癥狀最為明顯[2]。紅細(xì)胞期瘧原蟲(chóng)的能量來(lái)源主要依靠攝取宿主血液中的葡萄糖進(jìn)行糖酵解[3]。葡萄糖依次通過(guò)紅細(xì)胞膜表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）1、包繞瘧原蟲(chóng)的納蟲(chóng)泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）和瘧原蟲(chóng)質(zhì)膜上的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（hexose transporter，HT），最終進(jìn)入瘧原蟲(chóng)體內(nèi)[4]。由于無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生ATP 效率低下，瘧原蟲(chóng)需要攝取大量葡萄糖以維持正常生長(zhǎng)[5]。

GLUT1 在人體內(nèi)廣泛存在，是紅細(xì)胞和血-腦屏障中最主要的GLUT。有研究報(bào)道，對(duì)正常紅細(xì)胞和感染惡性瘧原蟲(chóng)（Plasmodium falciparum，P. falciparum）的紅細(xì)胞進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)感染紅細(xì)胞表面GLUT1 的磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變[6]；在伯式瘧原蟲(chóng)（Plasmodium berghei，P. berghei）感染的肝細(xì)胞階段，肝細(xì)胞會(huì)上調(diào)細(xì)胞表面GLUT1 的表達(dá)量和轉(zhuǎn)運(yùn)效率以增加葡萄糖的攝取[7]；而在人類(lèi)遺傳疾病GLUT1 缺陷綜合征中，GLUT1 磷酸化狀態(tài)的改變也會(huì)影響葡萄糖的正常吸收[8]。可見(jiàn)，GLUT1 的磷酸化水平對(duì)其在細(xì)胞表面的表達(dá)量及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率至關(guān)重要。

GLUT1 的磷酸化既可能引發(fā)胞漿內(nèi)的GLUT1囊泡轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，又可能調(diào)控細(xì)胞表面GLUT1 的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率。而紅細(xì)胞缺乏囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，只能通過(guò)調(diào)節(jié)GLUT1 轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的速率來(lái)調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取[8]。為了探究感染紅細(xì)胞GLUT1 磷酸化狀態(tài)對(duì)葡萄糖吸收的影響，本實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)對(duì)正常和感染惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，找到一些與瘧原蟲(chóng)感染相關(guān)的GLUT1 特異性磷酸化位點(diǎn)。由于紅細(xì)胞無(wú)法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，為了研究這些位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)在瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞中的作用，本研究首先擬在其他細(xì)胞中檢測(cè)這些位點(diǎn)的磷酸化對(duì)細(xì)胞表面GLUT1 表達(dá)量和轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖效率的影響。為了盡量降低內(nèi)源性GLUT1 對(duì)檢測(cè)的影響，選擇低表達(dá)GLUT1 的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3 進(jìn)行細(xì)胞表面GLUT1 表達(dá)水平的定量檢測(cè)。GLUT1為12 次跨膜蛋白，直接用抗體檢測(cè)GLUT1 的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域靈敏度較低[9]，且其N(xiāo) 端和C 端均朝向細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。因此，為了更為準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞表面GLUT1的表達(dá)水平，本研究首先通過(guò)分子克隆的方法，在人GLUT1 第一個(gè)胞外區(qū)中插入2×FLAG 序列，以pcDNATM4/TO/myc-His B 為載體，構(gòu)建pcDNA4-2×FLAG-GLUT1，并將其導(dǎo)入NIH/3T3 細(xì)胞中，利用抗FLAG 抗體，即可定量檢測(cè)細(xì)胞表面GLUT1 的表達(dá)水平，為后續(xù)探究瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞GLUT1 磷酸化位點(diǎn)的功能提供了必要的分子工具。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系、質(zhì)粒和菌株小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3 于本實(shí)驗(yàn)室保存，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNATM4/TO/myc-His B 由南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)院胡俊杰課題組提供，感受態(tài)細(xì)胞Mach1-T1 購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購(gòu)自美國(guó)NEB 公司，In-Fusion?HD Cloning試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，質(zhì)粒小提試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司，質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自Qiagen 公司；DMEM 培養(yǎng)基、LipofectaminTM2000 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；用于流式的anti-DYKDDDDK，山羊抗兔IgG（PE-conjugated）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，用于Western 印跡的anti-FLAG 抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 目的基因片段GLUT1-Ⅰ、GLUT1-Ⅱ和GLUT1-Ⅲ的獲取 以人類(lèi)GLUT1 基因編碼區(qū)（1～1479 bp）為模板，在GLUT1 的第一個(gè)胞外區(qū)序列中，即在第55 位氨基酸和第56 位氨基酸之間插入2個(gè)連續(xù)的FLAG 標(biāo)簽。首先進(jìn)行分段PCR，分別擴(kuò)增片段GLUT1-Ⅰ（GⅠ，1～165 bp）和GLUT1-Ⅰ′（GⅠ′，166～1479 bp），并在GⅠ的上、下游分別引入HindⅢ酶切位點(diǎn)和2×FLAG 序列，GⅠ′的上、下游分別引入部分1×FLAG 序列和BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)。以GⅠ′為模板進(jìn)一步擴(kuò)增出片段GLUT1-Ⅱ（GⅡ，166～541 bp）和GLUT1-Ⅲ（GⅢ，517～1479 bp）（PCR引物見(jiàn)表1）。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性98 ℃5 min，以98 ℃30 s，55 ℃20 s，68 ℃1 min，循環(huán)35 次，68 ℃終延伸5 min，4℃終止反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，切膠回收。

1.3.2 重組質(zhì)粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 的構(gòu)建 通過(guò)overlap PCR 將GⅠ和GⅡ連接得到片段GⅠ+Ⅱ（607 bp，引物為F231 和R382），利用In-Fusion 無(wú)縫克隆的方法將片段GⅠ+Ⅱ、GⅢ與經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切后的pcDNATM4/TO/myc-His B 質(zhì)粒連接（反應(yīng)條件為50℃，30 min）。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞Mach1-T1 中，在含氨芐的LB 固體培養(yǎng)基上密集涂布后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12～14 h，次日挑取單克隆于LB 液體培養(yǎng)基中搖菌擴(kuò)增后提取質(zhì)粒。酶切鑒定及DNA 測(cè)序確認(rèn)2×FLAG 序列成功插入GLUT1 第一個(gè)胞外區(qū)，得到重組質(zhì)粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。大量制備重組質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表1 構(gòu)建重組質(zhì)粒引物序列Tab 1 Construction of primer sequences of vector

1.3.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系NIH/3T3 在含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%時(shí)，根據(jù)LipofectaminTM2000 試劑說(shuō)明書(shū)，以O(shè)pitMEMTM培養(yǎng)液分別稀釋質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑，將兩者混勻后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，4～6 h 后更換培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 質(zhì)粒，對(duì)照組轉(zhuǎn)染pcDNA4 空載質(zhì)粒。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FLAG-GLUT1 的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，提取總蛋白，加入還原性上樣緩沖液后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；凝膠分離后通過(guò)濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上（100 V，2 h）；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；FLAG 抗體（1：1000 稀釋?zhuān)┖蛢?nèi)參β-actin 抗體（1：4000 稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜；次日以1×PBST 洗膜3 遍；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠第二抗體（1：4000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h；1×PBST 漂洗3 遍；采用化學(xué)發(fā)光法顯色并曝光。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面FLAG-GLUT1 表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h 使用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞解離，制成單細(xì)胞懸液；加入CD16/32 抗體（1∶200 稀釋?zhuān)?℃封閉15 min；再加入anti-DYKDDDDK 抗體（1∶1000稀釋?zhuān)?℃孵育1 h；1×PBS 洗滌后加入PE 耦聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶250 稀釋?zhuān)?℃孵育30 min；PBS 洗滌后過(guò)濾上機(jī)檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 為了檢測(cè)細(xì)胞表面GLUT1 表達(dá)量，在GLUT1 第一個(gè)胞外區(qū)Ser55 和Ile56 之間插入2×FLAG 序列，從而可以利用anti-DYKDDDDK 抗體經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的GLUT1 表達(dá)量。本實(shí)驗(yàn)選用pcDNATM4/TO/myc-His B 質(zhì)粒，含有真核基因CMV 強(qiáng)啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可大量表達(dá)目標(biāo)蛋白。

圖1 pcDNATM4/TO/myc-His B（左）與pcDNA4-2×FLAG-GLUT1質(zhì)粒圖譜（右）Fig 1 Plasmid profiles of pcDNATM4/TO/myc-His B(left)and pcDNA4-2×FLAG-GLUT1（right）

由于需要在GLUT1 蛋白內(nèi)部插入2×FLAG 序列，首先擴(kuò)增出GⅠ和GⅠ′片段（圖2A），在GⅠ末端引入2×FLAG 序列。鑒于GⅠ和GⅠ′片段大小差距較大，不易直接通過(guò)overlap PCR 進(jìn)行連接。因此，進(jìn)一步以GⅠ′為模板分別擴(kuò)增GⅡ和GⅢ兩個(gè)小片段（圖2B）。經(jīng)overlap PCR 連接片段GⅠ和G Ⅱ，利用In-Fusion 無(wú)縫克隆技術(shù)將片段G Ⅰ+Ⅱ和GⅢ同時(shí)插入線(xiàn)性化的質(zhì)粒pcDNA4，即得到重組質(zhì)粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1。重組質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和BamHⅠ雙酶切鑒定插入片段大小正確（圖2C），DNA 測(cè)序無(wú)誤。

圖2 重組質(zhì)粒pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 的構(gòu)建及鑒定Fig 2 Construction and identification of plasmid pcDNA4-2 ×FLAG-GLUT1

2.2 轉(zhuǎn)染后NIH/3T3 細(xì)胞FLAG-GLUT1 的表達(dá) NIH/3T3 細(xì)胞經(jīng)pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)入的GLUT1 的表達(dá)水平。用anti-FLAG 抗體檢測(cè)細(xì)胞中FLAG-GLUT1 的總表達(dá)量，以β-actin 作為內(nèi)參。與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒相比，在40～50 kD間有一條特異性條帶（圖3 箭頭處），大小與GLUT1 蛋白分子量符合，提示pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 被導(dǎo)入NIH/3T3 細(xì)胞后FLAG-GLUT1 表達(dá)正常。

圖3 Western 印跡檢測(cè)NIH/3T3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后FLAG-GLUT1 蛋白的表達(dá)量Fig 3 Detection of the amount of FLAG-GLUT1 in NIH/3T3 cells by Western blotting

2.3 NIH/3T3 細(xì)胞表面GLUT1 的定量檢測(cè) NIH/3T3 細(xì)胞經(jīng)pcDNA4-FLAG-GLUT1 轉(zhuǎn)染后，用anti-DYKDDDDK 抗體識(shí)別細(xì)胞表面FLAG 標(biāo)記的GLUT1 的表達(dá)情況。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞表面可檢測(cè)到FLAG-GLUT1 的表達(dá)，陽(yáng)性群比例為（21.46±2.375）%，明顯高于對(duì)照組（0.01±0.00）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.035，P＜0.01）（圖4），提示可以通過(guò)FLAG 抗體檢測(cè)細(xì)胞表面FLAGGLUT1 的表達(dá)量的變化。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面FLAG-GLUT1 的表達(dá)Fig 4 Detection of FLAG-GLUT1 expression on cell surface by flow cytometry

3 討論

瘧原蟲(chóng)在人體細(xì)胞內(nèi)寄生需要攝取大量的葡萄糖供能，以維持其生長(zhǎng)發(fā)育。在瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞期，葡萄糖主要以無(wú)氧糖酵解的方式提供能量。目前已建立了惡性瘧原蟲(chóng)葡萄糖代謝相關(guān)的酶動(dòng)力學(xué)模型，為潛在的藥物治療靶標(biāo)研究提供了工具[10]。有研究報(bào)道，瘧原蟲(chóng)質(zhì)膜上的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也可能成為潛在的藥物治療靶標(biāo)，通過(guò)限制葡萄糖的攝取抑制瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育[4，11-12]。

葡萄糖是各種生物最基本的能量來(lái)源，主要通過(guò)細(xì)胞膜上的GLUTs 被細(xì)胞吸收，其中以GLUT1、2、3、4 的生理功能最為重要，GLUT1 因發(fā)現(xiàn)最早而得名。GLUTs 屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（major facilitator superfamily，MFS），具有典型的折疊模式，由12個(gè)跨膜螺旋組成N 端和C 端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，各包含了一對(duì)重復(fù)的反向結(jié)構(gòu)[13]。GLUT1 的失活突變會(huì)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，導(dǎo)致癲癇、大腦萎縮和發(fā)育遲緩等一系列癥狀，稱(chēng)為GLUT1 缺陷綜合征。通過(guò)比較捕獲到的GLUT1 和木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白XyIE 的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，GLUT1 轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制可能是通過(guò)胞內(nèi)區(qū)4個(gè)α 螺旋組成的結(jié)構(gòu)域（intracellular helical bundle，ICH）與C 端的相互作用介導(dǎo)的[14]。在GLUT1 缺陷綜合征已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)中，可能主要通過(guò)影響ICH 與C 端的相互作用從而影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ATP 充足時(shí)，ATP 與GLUT1 結(jié)合，引起GLUT1 的loop6-7 和C 端的相互作用，進(jìn)而抑制其對(duì)葡萄糖的吸收[15]。有研究表明，GLUT1 的Ser226位點(diǎn)的磷酸化可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面GLUT1 的表達(dá)量和GLUT1 的活性，增加葡萄糖的吸收[8]。在肌肉組織中，GLUT1 的Ser490 位點(diǎn)的磷酸化也通過(guò)相似的機(jī)制增加葡萄糖的吸收[16]。上述位點(diǎn)的磷酸化可能改變了GLUT1 內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，影響N 端和C端的相互作用，從而影響葡萄糖的吸收速率。因此，通過(guò)對(duì)正常和感染惡性瘧原蟲(chóng)的紅細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，篩選出可能的與瘧原蟲(chóng)感染的特異性磷酸化位點(diǎn)，從而進(jìn)一步分析其功能。

本研究構(gòu)建的pcDNA4-2×FLAG-GLUT1 重組質(zhì)粒，在GLUT1 第一個(gè)胞外區(qū)中間插入2×FLAG 序列，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可通過(guò)FLAG 抗體檢測(cè)細(xì)胞表面GLUT1 表達(dá)水平的變化。與常規(guī)的直接用GLUT1抗體檢測(cè)細(xì)胞表面GLUT1 的表達(dá)相比，具有更高的靈敏度。由于無(wú)法對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，在后續(xù)的研究中，擬在低表達(dá)GLUT1 的NIH/3T3 細(xì)胞中對(duì)質(zhì)譜篩選出的候選位點(diǎn)進(jìn)行模擬磷酸化和去磷酸化點(diǎn)突變，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面FLAG-GLUT1 表達(dá)水平的變化，首先明確特定位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)是否與GLUT1 囊泡轉(zhuǎn)位相關(guān)；繼而在體外將純化蛋白FLAG-GLUT1，并重組至脂質(zhì)體中，借助3H 標(biāo)記的2-脫氧-D-葡萄糖檢測(cè)其轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的速率，鑒定這些磷酸化位點(diǎn)對(duì)GLUT1 活性和表達(dá)量的影響，從而推測(cè)GLUT1 的磷酸化在瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞發(fā)揮的潛在功能。

綜上所述，GLUT1 對(duì)于瘧原蟲(chóng)在紅細(xì)胞期的生長(zhǎng)發(fā)育十分重要，本研究不僅為檢測(cè)GLUT1 在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平提供了有力的工具，更有助于后續(xù)進(jìn)一步研究GLUT1 磷酸化在瘧原蟲(chóng)感染過(guò)程中的作用。