IL-17A 可以促進卵巢癌的腹腔轉(zhuǎn)移

李巖，牛秀瓏，郁春艷，陳燕，沈洋洋，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系，國家教育部免疫微環(huán)境與疾病重點實驗室，天津300070；2.中國人民武裝警察部隊特色醫(yī)學中心勤務環(huán)境皮膚疾病防治研究所，天津300162）

卵巢癌（ovarian cancer，OvCa）是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，轉(zhuǎn)移和耐藥使OvCa 的5年生存率為30%左右，病死率居于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位[1]。研究發(fā)現(xiàn)，OvCa 患者體內(nèi)白細胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）水平增高，且與腫瘤進展密切相關[2]。IL-17A 是IL-17 細胞因子家族中（IL-17A～IL-17F）最早被發(fā)現(xiàn)也最具有代表性的一員，是一種多效性炎癥因子，主要通過IL-17RA發(fā)揮作用[3-4]。同時有研究表明IL-17A 是血管生成因子，IL-17A 在腫瘤組織中的高表達與腫瘤的血管生成有密切聯(lián)系，而血管生成又與腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲密切相關[5]。腹腔轉(zhuǎn)移是OvCa 最常見的轉(zhuǎn)移方式[6]，但IL-17A 在OvCa 腹腔轉(zhuǎn)移中的作用及其相關機制未見報道，需進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠OvCa 細胞系ID8 細胞由堪薩斯大學醫(yī)療生殖中心惠贈；C57BL/6 遺傳背景的野生型（WT）小鼠購自中國軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心；C57BL/6 遺傳背景的IL-17A-/-小鼠購自日本東京理科大學生物醫(yī)學科學研究所動物疾病模型中心；DMEM 培養(yǎng)基購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO 公司；rmIL-17A 購自美國PeproTech 公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）和人工基底膜基質(zhì)凝膠Matrigel 購自美國BD 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) ID8 細胞以含10%FBS 的DMEM，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠體內(nèi)實驗 將ID8 細胞注射于6 周齡雌性WT 小鼠和IL-17A-/-小鼠腹腔內(nèi)（5×106/200 μL/鼠，n=6 只），6 周后頸椎脫位處死小鼠，打開腹腔，觀察瘤結節(jié)生成情況，計數(shù)并拍照。

1.2.3 MTT 實驗 將ID8 細胞接種于96 孔板中（4×103/100 μL/孔）。24 h 后更換培養(yǎng)液，加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同時對照組加入等體積的生理鹽水，所有組設置5個平行孔；繼續(xù)培養(yǎng)12 h、24 h、48 h。培養(yǎng)結束前4 h，避光加入MTT（終濃度0.5 mg/mL）。培養(yǎng)結束后離心棄上清，加入DMSO（100 μL/孔），酶標儀檢測波長為490 nm 的光密度值（OD490）。

1.2.4 細胞劃痕實驗 將ID8 細胞接種于12 孔板中（2×105/mL/孔）；待細胞貼壁后，劃線，清洗去除脫落細胞；加入含2%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基（1 mL/孔），加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同時對照組加入等體積的生理鹽水。分別于0 h、6 h、12 h、24 h 在顯微鏡下拍照，應用Quantity One 4.5.6 軟件分析各組劃痕間距。

1.2.5 Transwell 侵襲實驗 將ID8 細胞接種于鋪有Matrigel 膠的Transwell 上室（5×104/200 μL/孔）；在下室加入500 μL 含1%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，同時加入1 ng/mL、10 ng/mL rmIL-17A，同時對照組加入等體積的生理鹽水，常規(guī)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結束后，取出上室，進行漂洗，并拭去未穿膜的細胞，以4%多聚甲醛固定，用0.1%結晶紫染液染色，顯微鏡下拍照并統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用GraphPad prism 5 進行統(tǒng)計學分析并繪圖，最終結果以±s 表示。兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 內(nèi)源性IL-17A 促進小鼠OvCa 腹腔內(nèi)廣泛生長 在接種ID8 細胞6 周后處死小鼠，結果發(fā)現(xiàn)，WT 小鼠腹腔內(nèi)腸系膜、脾臟、腎臟表面和腹膜后淋巴結處可見密集轉(zhuǎn)移灶；而IL-17A-/-小鼠腹腔內(nèi)僅橫膈部位有較密集轉(zhuǎn)移灶，腸系膜、脾臟和腎臟表面可見極少轉(zhuǎn)移灶（圖1A 箭頭所示）。WT 組小鼠腹腔內(nèi)瘤結節(jié)數(shù)量明顯高于IL-17A-/-組小鼠（56.67±5.37 vs. 14.37±3.68，P＜0.01，圖1B）。

圖1 內(nèi)源性IL-17A 促進小鼠OvCa 腹腔內(nèi)成瘤Fig 1 Endogenous IL-17A promoted tumor formation of OvCa in abdomen in mice

2.2 rmIL-17A 對ID8 細胞增殖的作用 MTT 實驗結果表明，rmIL-17A 不影響ID8 細胞的增殖。如圖2 所示，在0～48 h 內(nèi)ID8 細胞增殖能力均呈增加趨勢，但與對照組相比，不同濃度的rmIL-17A 對ID8細胞增殖沒有影響（P＞0.05）。

圖2 rmIL-17A 對ID8 細胞增殖的作用Fig 2 Effects of rmIL-17A on the proliferation of ID8 cells

2.3 rmIL-17A 對ID8 細胞遷移的作用 細胞劃痕實驗結果表明，rmIL-17A 可促進ID8 細胞遷移。如圖3 所示，與對照組相比，10 ng/mL 的rmIL-17A作用6 h 后可促進ID8 細胞遷移（P＜0.05），1 ng/mL和10 ng/mL 的rmIL-17A 作用12 h 后可顯著促進ID8 細胞遷移（對照組：71.67±2.62；1 ng/mL 組：50.67±2.49；10 ng/mL 組：48.00±3.74；均P＜0.01）。

圖3 rmIL-17A 對ID8 細胞遷移能力的作用Fig 3 Effects of rmIL-17A on the migration of ID8 cells

2.4 rmIL-17A 對ID8細胞侵襲能力的作用 Transwell侵襲實驗結果表明，rmIL-17A 可促進ID8 細胞的侵襲能力（圖4A）。

圖4 rmIL-17A 對ID8 細胞侵襲能力的作用Fig 4 Effects of rmIL-17A on the invasion of ID8 cells

如圖4B 所示，干預24 h 后，1 ng/mL rmIL-17A 組穿膜細胞數(shù)為153.00±9.41，10 ng/mL rmIL-17A 組穿膜細胞數(shù)為169.00±10.89，而對照組僅為0.33±0.47（均P＜0.01）。

3 討論

轉(zhuǎn)移是晚期OvCa 患者死亡的主要原因之一[7-9]。但目前對OvCa 轉(zhuǎn)移、侵襲的機制還不甚了解，而OvCa 細胞轉(zhuǎn)移、侵襲和腹腔內(nèi)生長是決定OvCa 腹腔轉(zhuǎn)移的重要步驟[10-12]。本研究通過體內(nèi)、體外實驗研究，證實IL-17A 可以促進OvCa 的腹腔轉(zhuǎn)移。

體外劃痕實驗表明，rmIL-17A 可以促進ID8 細胞的遷移。此外，體外的侵襲實驗表明rmIL-17A 可以促進ID8 細胞的侵襲。有研究表明，IL-17A 可以通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2 和MMP-9 表達，增強人肺腺癌A549 細胞的侵襲能力[13]。但關于IL-17A 對OvCa 侵襲能力的影響還未見報道，需要進一步探索其機制。

本研究以相同基因背景的IL-17A-/-小鼠和WT小鼠為荷瘤動物模型，檢測內(nèi)源性IL-17A 對腹腔內(nèi)OvCa 生長的影響。發(fā)現(xiàn)WT 組小鼠腹腔內(nèi)瘤結節(jié)數(shù)量明顯高于IL-17A-/-組小鼠，腫瘤轉(zhuǎn)移灶明顯多于IL-17A-/-組小鼠，表明內(nèi)源性IL-17A 可以促進Ov-Ca 細胞在腹腔內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移。然而，體外MTT 實驗結果表明，無論低濃度（1 ng/mL）或高濃度（10 ng/mL）的rmIL-17A 都不影響ID8 細胞的增殖。體內(nèi)、外實驗結果矛盾的原因，可能與IL-17A 具有促進血管生成的作用相關[14-15]。文獻報道在OvCa 的組織切片中IL-17A 呈現(xiàn)強陽性，加速了OvCa 的血管生成[16]，而血管生成在腫瘤轉(zhuǎn)移中扮演著不可或缺的角色，新生血管可以為腫瘤提供所需的營養(yǎng)和氧氣[17]。此外，研究表明，脂肪酸結合蛋白（FABP）4 可以介導脂肪酸進入腫瘤細胞，進行β 氧化，為腫瘤細胞生長和腹腔轉(zhuǎn)移提供能量[18]。本課題組以前的結果發(fā)現(xiàn)FABP4 是IL-17A 激活的下游效應蛋白，IL-17A可能通過促進FABP4 表達而促進脂肪酸進入腫瘤細胞發(fā)揮作用[2]，這可能是IL-17A 促進卵巢癌腹腔轉(zhuǎn)移的另一個機制。

綜上所述，本研究通過體內(nèi)、體外研究，證實IL-17A 可以促進OvCa 的腹腔轉(zhuǎn)移，為OvCa 腹腔轉(zhuǎn)移的臨床干預提供了新的思路和策略。