基因表達(dá)譜分析肝細(xì)胞癌的特征基因

張萃萃，鄧為民

（1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津300070；2.天津市血液中心發(fā)血科，天津300110）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝癌中最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，占肝癌病例的75%～85%[1]。在世界范圍內(nèi)每年約有841000例HCC 新增病例和782000例死亡病例[2]。乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis Cvirus,HCV）是導(dǎo)致HCC 發(fā)展的重要原因[3]。病毒誘導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制涉及多種機(jī)制，例如HBV-DNA 整合進(jìn)入宿主遺傳系統(tǒng)、DNA 甲基化以及氧化應(yīng)激[4-5]。肝臟慢性疾病是由于病毒通過各種受體介導(dǎo)的機(jī)制持續(xù)進(jìn)入宿主細(xì)胞而導(dǎo)致的，這些機(jī)制包括感染免疫防御控制中心、病毒抑制抗原呈遞、選擇性免疫抑制、病毒基因表達(dá)下調(diào)和病毒突變能夠通過識(shí)別HBV 抗原使病毒特異性T 細(xì)胞功能失效等[6]。盡管HBV 和HCV 引起的病毒性肝炎與HCC 高度相關(guān)，但仍有一些非病毒因素可誘發(fā)HCC 的發(fā)生和發(fā)展，如糖尿病、酒精濫用、心血管疾病、肝臟炎癥、肥胖、血脂異常和非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等[7-9]。

如果在早期發(fā)現(xiàn)，HCC 患者可以得到良好的治療，主要的治療手段是手術(shù)切除或者肝移植[10]。但是，大多數(shù)HCC 患者都在晚期才得到確診，此時(shí)已經(jīng)無法進(jìn)行有效的手術(shù)治療，轉(zhuǎn)而采取化療的方式破壞癌細(xì)胞并抑制癌細(xì)胞的增殖，治療效果不盡如人意[11]。綜上所述，HCC 治療的關(guān)鍵是及早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診斷和手術(shù)治療。然而目前，HCC 仍然缺少最為有效的腫瘤標(biāo)志物。臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物陽(yáng)性率尚無法令人滿意，誤診情況屢有出現(xiàn)。為此，本研究結(jié)合生物信息學(xué)和臨床檢驗(yàn)方法，篩選出HCC 中兩個(gè)最為重要的靶點(diǎn)基因，然后構(gòu)建了診斷模型，并且在臨床樣本中進(jìn)行一對(duì)一精確驗(yàn)證。該研究豐富了HCC 的早期診斷，為該疾病的研究提供了理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 差異基因篩選 數(shù)據(jù)源HCC 患者樣本數(shù)據(jù)獲取自TCGA（the cancer genome atlas）數(shù)據(jù)庫(kù)。本項(xiàng)目下載了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中426例HCC 的mRNA 數(shù)據(jù)，426例樣本中包含340例癌癥樣本和86例配對(duì)癌旁樣本。TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接為：https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/。本實(shí)驗(yàn)使用R 語(yǔ)言中的edgeR 包分析不同組之間差異表達(dá)的基因（differentially expressed genes, DEGs），以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的差異表達(dá)倍數(shù)（Log2FC）的絕對(duì)值＞1 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。

1.2 富集通路分析

1.2.1 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)和核心基因的識(shí)別 本項(xiàng)目利用STRING（https://string-db.org/，version 11.0）分析蛋白質(zhì)的功能聯(lián)系及蛋白質(zhì)的相互作用，保留綜合得分大于等于0.4 的相互作用對(duì)。用Cytoscape（https://cytoscape.org/,version 3.7.2）可視化PPI 網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 軟件中的MCODE 插件識(shí)別顯著的聚類模塊，以MCODE score ＞2 為閾值進(jìn)行篩選。

1.2.2 功能富集分析 用R 語(yǔ)言的clusterProfiler 包做GO（gene ontology）（包括biological process、molecular function 和cellular component）及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集分析，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選顯著富集的GO 和KEGG 通路。

1.3 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測(cè)1.3.1 研究對(duì)象 回顧性分析天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院2018年1月-2019年12月經(jīng)病理確診的HCC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例均經(jīng)病理證實(shí)；有完整的影像學(xué)檢查資料；未經(jīng)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他腫瘤病史；存在其他肝臟慢性疾病。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（KY2018C278），并與患者或家屬簽署知情同意書。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，將試驗(yàn)對(duì)象分為兩組：HCC 陽(yáng)性患者為HCC 組，共195例，其中男性114例，女性81例；HCC 陰性正常人群為對(duì)照組，共107 名，其中男性60 名，女性47 名。1.3.2 ELISA檢測(cè) SLC7A11（solute carrier family 7 member11）和CCDC（Coiled-coil domain-containing）14 濃度測(cè)定采用ELISA 雙抗體夾心法，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行（試劑盒選自Abcam 公司）,本項(xiàng)目的待測(cè)樣品提取自外周血。為了減少待測(cè)人群凍存后細(xì)胞數(shù)量和檢測(cè)因子受損嚴(yán)重情況，影響指標(biāo)檢測(cè)，本項(xiàng)目樣本采用新鮮提取的外周血，分批次對(duì)待測(cè)人群進(jìn)行檢驗(yàn)，最終的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一整理。標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 mL，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；以此類推，逐步稀釋，最終稀釋后各孔加樣量都為50 μL，濃度分別為24 μg/L、16 μg/L、8 μg/L、4 μg/L 和2 μg/L；加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。配液：將30 倍（48T 的20 倍）濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍（48T 的20 倍）稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去，如此重復(fù)5 次，拍干。加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。進(jìn)一步溫育和洗滌。顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。測(cè)定：以空白調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15 min 以內(nèi)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2013 軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SAS 9.4 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的變量以±s 表示，采用SAS 9.4 中的Paired-t test 方法用于數(shù)據(jù)比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的分析結(jié)果 為了消除批次誤差效應(yīng)，本項(xiàng)目首先對(duì)芯片原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（圖1A）。340例HCC 樣本和86例癌旁樣本進(jìn)行基因差異化分析結(jié)果顯示：454個(gè)基因表現(xiàn)出顯著性差異，可列為DEGs，其中上調(diào)基因234個(gè)，下調(diào)基因220個(gè)（圖1B）。

圖1 HCC 和癌旁組織差異基因分析Fig 1 Analysis of differentially expressed genes in HCC cancer samples and adjacent tissues

2.2 富集分析結(jié)果 通過基因富集分析，差異表達(dá)基因主要集中在neuroactive ligand-receptor interaction 通路中（圖2A）。PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選出針對(duì)HCC 發(fā)展最重要的10個(gè)基因，其中SLC7A11 和CCDC14 排名最靠前，意味著這兩個(gè)基因在HCC 形成中的重要性最高（圖2B）。

圖2 KEGG 富集分析結(jié)果和PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選的重要基因Fig 2 Results of KEGG enrichment analysis and important genes screened by PPI network

2.3 SLC7A11 和CCDC14 檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，HCC 組SLC7A11 濃度顯著升高；CCDC14 濃度亦有明顯提高。以發(fā)現(xiàn)的正常最高值作為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，SLC7A11 和CCDC14 針對(duì)HCC 檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測(cè)（±s）Tab 1 Analysis of concentration for SLC7A11 and CCDC14（±s）

表1 SLC7A11 和CCDC14 濃度檢測(cè)（±s）Tab 1 Analysis of concentration for SLC7A11 and CCDC14（±s）

注：HCC：肝細(xì)胞癌；與對(duì)照組相比，*P＜0.05

組別 SLC7A11（ng/mL） CCDC14（pg/mL）HCC 組 70.12±14.30* 6.17±2.31*對(duì)照組 23.12±7.11 2.13±0.84 t 6.17 5.35 P＜0.001 ＜0.001陽(yáng)性率（%） 80.20 68.80

3 討論

HCC 治療效果主要取決于早期精確診斷、及時(shí)的手術(shù)治療以及有效的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。然而，目前臨床上該惡性腫瘤尚缺乏令人滿意的臨床標(biāo)志物。甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）是目前全世界應(yīng)用最廣泛的HCC 腫瘤標(biāo)志物，診斷HCC 的敏感度為39%～65%，特異度為76%～94%。其敏感度和特異度均不令人十分滿意，尤其在具有小腫塊的HCC 早期階段，80%的患者血清AFP 并未見明顯升高。近幾年HCC 的基礎(chǔ)和臨床研究也提出了若干新型腫瘤標(biāo)志物[12]。例如高爾基體蛋白73（golgi protein 73，GP73）和甲胎蛋白異質(zhì)體3（alpha fetoprotein-L3，AFP-L3）等。GP73 在正常人的肝細(xì)胞中表達(dá)量極低或者不表達(dá)，而在HCC 患者血清中明顯升高，然而有諸多報(bào)道證實(shí)肝炎和脂肪肝患者中也存在著GP73 水平顯著升高。AFP-L3 是AFP 異質(zhì)體的一種。AFP-L3 為肝癌細(xì)胞特有，當(dāng)臨界值設(shè)為10%～15% 時(shí)，約1/3 的小肝癌（＜3 cm）患者血清AFP-L3陽(yáng)性；而＞15%時(shí)，AFP-L3 的敏感度為75%～96.9%，特異度為90%～92%。然而有文獻(xiàn)對(duì)于AFP-L3 在HCC診斷方面有效性的報(bào)道卻不一致，一項(xiàng)納入12 篇文章的Meta 分析指出AFP-L3 比AFP 有更高的特異度，但敏感度較低[13]?；谶@些事實(shí)，有必要尋找更有效、更可靠的HCC 臨床標(biāo)志物。

本研究對(duì)TCGA 中HCC 樣品和癌旁對(duì)照樣品進(jìn)行了差異表達(dá)基因分析，以揭示潛在的關(guān)鍵性差異基因。實(shí)驗(yàn)從340個(gè)癌癥樣本和86個(gè)相鄰對(duì)照樣本中篩選了454個(gè)差異基因，其中高表達(dá)的234個(gè)，低表達(dá)的220個(gè)。這些差異基因主要集中在神經(jīng)活性配體-受體通路中。Liu 等[14]實(shí)驗(yàn)證明神經(jīng)活性配體-受體通路與HCC 相關(guān)，因?yàn)橹T多在人肝中表達(dá)的基因參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用途徑。另外，Zhao 等[15]發(fā)現(xiàn)，肝癌的早期、中期和晚期都存在神經(jīng)活性的配體-受體相互作用。因此，該途徑在HCC進(jìn)展中似乎很重要。

本項(xiàng)目確定了若干個(gè)有顯著表達(dá)差異的基因，其中最為突出的兩個(gè)基因是SLC7A11 和CCDC14，這為將來的研究提供了非常有價(jià)值的起點(diǎn)。SLC7A11 是廣泛存在于肝細(xì)胞膜上面的特異性離子進(jìn)出通道，之前有報(bào)道稱其在HCC 存在差異性表達(dá)。SLC7A11 在HCC 中的差異性表達(dá)可能與HCC 變異細(xì)胞中特定改變的分子信號(hào)有密切聯(lián)系[16]。CCDC 卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)基因，其表觀遺傳的改變已經(jīng)證實(shí)與包括鼻咽癌、胰腺癌、前列腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤息息相關(guān)。其在HCC 中的作用尚未明了[17]。

總體而言，本項(xiàng)目全面揭示HCC 的差異性基因圖譜，并且提出了兩個(gè)可行的創(chuàng)新臨床腫瘤標(biāo)志物，為HCC 臨床診斷和治療提供了新的思路。本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了使SLC7A11 和CCDC14 作為HCC 特異性的標(biāo)志物廣泛地應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)，未來還需要進(jìn)行多中心、大樣本量研究。