高脂飲食抑制胰島素受體和膽囊收縮素受體在小鼠肝臟中的表達(dá)

李秋菊，胡立娟，陳喜娟，邱帥，王豐

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津南開醫(yī)院，天津市急腹癥器官損傷與中西醫(yī)結(jié)合修復(fù)重點(diǎn)實驗室，天津300100）

胰島素是胰島β 細(xì)胞分泌的肽類激素[1],分泌后經(jīng)門靜脈進(jìn)入肝臟,與肝細(xì)胞表面的胰島素受體（insulin receptor，IR）結(jié)合，促進(jìn)肝細(xì)胞葡萄糖和脂類的利用[2]。持續(xù)高脂飲食（high fat diet，HFD）的攝入能導(dǎo)致肝臟發(fā)生胰島素抵抗，繼發(fā)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，引發(fā)非酒精性脂肪肝炎、肝硬化等[3]。食物中的脂肪和蛋白分解物經(jīng)上段小腸時會刺激黏膜內(nèi)的I細(xì)胞向血中分泌膽囊收縮素（cholecystokinin,CCK）[4]繼而引發(fā)膽囊收縮和膽汁與胰液的外分泌，有助于蛋白和脂肪的消化與吸收[5]。作為膽汁生成的器官，肝臟的細(xì)胞能表達(dá)CCK 受體（cholecystokinin receptor，CCKR）。研究表明，該受體的表達(dá)異常參與了多個肝臟疾患的發(fā)生、發(fā)展[6-7]。

CCK 和胰島素是組成內(nèi)分泌系統(tǒng)腸-胰軸的重要激素[8]，協(xié)調(diào)食物的消化吸收[9]，并與肥胖和肝病的發(fā)生密切相關(guān)[3，7]。研究表明，肥胖小鼠的胰島β細(xì)胞不僅分泌胰島素，還產(chǎn)生CCK，并刺激胰島素分泌，促進(jìn)β 細(xì)胞增殖，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。胰島素和CCK 的這種異常分泌是對肥胖的適應(yīng)性改變[10]。而肝臟作為胰島素和CCK 的靶器官，其IR 和CCKR如何對HFD 作出應(yīng)答還未被闡明。此次，筆者在進(jìn)食HFD 的小鼠中研究了其肝臟中IR 和CCKR 的表達(dá)，胰腺中β 細(xì)胞群落和胰島素儲量的變化。

1 材料與方法

1.1 動物和材料 46 只雄性Balb/c 小鼠和普通小鼠飼料購自中國北京華阜康生物科技有限公司，該飼料含碳水化合物（56%w/w）、粗蛋白提取物（19%w/w）和粗脂肪提取物（5% w/w），其脂肪含量為5%，并在實驗1 周前用于全部小鼠，也作為對照飼料（control diet，CD）在實驗中用于對照組小鼠。向研磨成粉的CD 中加入15%和30%的豬油，制得兩個HFD，壓縮成形并消毒后儲存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

β-tubulin 抗體購自Santa Cruz 公司（47778），IR 抗體購自Abcam 公司（ab69508），CCKR 抗體購自Affinity 公司（DF4914），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體購自上海良森生物科技有限公司，鼠源胰島素單克隆抗體購自上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。卵白素-生物素-酶復(fù)合物（ABC）染色法試劑盒購自美國Vector 公司，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）法顯色試劑盒購自于美國Millipore公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購于美國Thermo 公司，放射免疫（RIA）試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司。為準(zhǔn)備實驗所用的血液容器，向EP 管中加入10 μL EDTA（15%）溶液，并隨即烘干備用。

1.2 動物管理 小鼠抵達(dá)時4～5 周齡，體重14～16 g。飼養(yǎng)于南開醫(yī)院動物實驗中心SPF 級動物房，12 h/12 h 循環(huán)光照，所有實驗小鼠自由攝食和飲水。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)CD 1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組：對照餐組16 只，進(jìn)食含有15%脂肪的HFD 組（15%HFD 組）15 只，進(jìn)食含有30%脂肪的HFD 組（30%HFD 組）15 只。每周監(jiān)測小鼠體重，而每日進(jìn)食量在眾多文獻(xiàn)中已有清楚記載[11-12]，故不贅述，共飼養(yǎng)12 周。

用外周和門靜脈兩次取血的方法獲得了測定胰島素和CCK 所需的血漿。為此，在第10 周時使用毛細(xì)管行內(nèi)眥采血（250 μL），3000 r/min 離心15 min，吸取上層血漿，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?2 周末，用三溴乙醇和叔戊醇混合物按125 mg/kg 腹腔注射麻醉動物，剖開腹腔，暴露門靜脈，用采血針（0.55 mm×19 mm）取門脈血，同前法獲取血漿置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆??？焖偃∫认俳M織平分兩份，一份放入福爾馬林中，另一份于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。快速取肝臟、腹股溝棕色脂肪組織（inguinal brown adipose tissue，BAT）和附睪白色脂肪組織（epididymal white adipose tissue，WAT）稱重，并將肝臟放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)檢測 所用的蛋白印跡法和免疫組化法詳見參考文獻(xiàn)[13-14]。在免疫組化中，每組含至少5 只小鼠胰腺，每張切片至少隨機(jī)獲取3個視野，通過顯微鏡（400×）攝取影像，β 細(xì)胞內(nèi)胰島素呈棕黃色，胞核呈藍(lán)色。用鏤空方格法計算胰島素陽性的β 細(xì)胞面積，及其在胰島總面積中的占比。

胰腺內(nèi)胰島素測定：用預(yù)冷的PBS（pH7.4）沖洗胰腺組織，將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（含蛋白酶抑制劑）在冰上進(jìn)行超聲破碎，5000 r/min 離心10 min 后取上清。按ELISA 試劑盒說明書的步驟測定胰島素含量。血漿中胰島素水平用同一ELISA 試劑盒測定。按RIA 試劑盒說明書的步驟操作，測定血漿CCK 的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±sx表示，兩組間比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HFD 對小鼠體重、脂肪組織質(zhì)量、肝臟質(zhì)量的影響 與對照餐組相比，15%HFD 組及30%HFD 組小鼠體重均增加（P＜0.01）（圖1A）。此外，含30%HFD 組小鼠的肝臟質(zhì)量（圖1B）和兩處脂肪組織的質(zhì)量（圖1C 和1D）增加（P＜0.01）。

圖1 HFD對小鼠體重、脂肪組織質(zhì)量、肝臟質(zhì)量的影響Fig 1 Effects of HFD on body weight，fat tissue weight and liver weight in mice

2.2 HFD 對小鼠肝臟IR 和CCK1R 的影響 與對照餐組相比，15%HFD 組及30%HFD 組小鼠肝臟IR的表達(dá)水平均下降（P＜0.01）（圖2A）。30%HFD 組肝臟中CCK1R 表達(dá)水平也較對照餐組下降（P＜0.05）（圖2B）。

圖2 HFD對小鼠肝臟IR和CCK1R表達(dá)的影響Fig 2 Effects of HFD on the expression of IR and CCK1R in mouse liver

2.3 HFD 對小鼠胰腺內(nèi)胰島素的影響 15%HFD組和30%HFD 組小鼠胰腺內(nèi)β 細(xì)胞面積與對照餐組相比逐漸上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖3）。

圖3 HFD 對小鼠胰腺內(nèi)胰島素的影響Fig 3 Effects of HFD on insulin in pancreas

此外，當(dāng)用ELISA 直接檢測胰腺組織中胰島素的含量時，也發(fā)現(xiàn)了和免疫組化實驗相似的趨勢，即15%HFD 組和30%HFD 組小鼠胰腺內(nèi)胰島素含量與對照餐組相比呈上升趨勢，并在30%HFD 組呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）（圖4A）。

圖4 HFD 對小鼠胰腺組織中胰島素和血漿胰島素的影響Fig 4 Effects of HFD on insulin contents in pancreatic tissue and in plasma

2.4 HFD對小鼠血漿胰島素和CCK 的影響 30%HFD 組門脈胰島素濃度較對照餐組升高，較同組小鼠外周血的胰島素濃度也升高（P＜0.01）（圖4B）。

高脂飲食不影響小鼠門脈血和外周血CCK 濃度，兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，結(jié)果未展示）。

3 討論

肥胖在起源上是多因素的，但在許多情況下，肥胖是由于進(jìn)食過多的高脂飲食而引起的，不同的脂肪含量和脂肪類型對胰島素的敏感性有不同的影響[15]。含有大量飽和脂肪如豬油、牛脂、椰子油的飲食更易誘發(fā)肥胖和胰島素抵抗，而含有不飽和脂肪酸的飲食如魚油和來自各種種子的油卻可能對胰島素敏感性產(chǎn)生有益的作用[16]。本研究結(jié)果也再次證明了攝入過量豬油會誘發(fā)肥胖這一事實。高脂飲食時，β 細(xì)胞通過多種方式增強(qiáng)胰島素的分泌能力，包括加快細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡[17]。IR 介導(dǎo)肝臟對胰島素的利用[3]。胰島素抵抗時，一個重要特征就是肝臟胰島素清除率隨IR 表達(dá)水平的降低而降低[18]。本研究結(jié)果顯示，隨脂肪濃度的增加，小鼠胰腺內(nèi)胰島素濃度逐漸增加而肝臟內(nèi)的IR 表達(dá)水平降低，表明高胰島素血癥可能是胰腺高分泌和肝臟胰島素清除率降低共同作用的結(jié)果，胰島素代謝的這種適應(yīng)性變化可能參與了HFD 導(dǎo)致的肥胖和胰島素拮抗時的代謝再平衡[3]。

脂質(zhì)飲食可以提高CCK 基因在CCK 生成細(xì)胞（I 細(xì)胞）中的表達(dá)[19]，這與脂質(zhì)刺激人類CCK 分泌增加的結(jié)果一致[20]。CCK 與CCK1R 相互作用介導(dǎo)攝食調(diào)節(jié)，具有CCK1R 亞型特異性的拮抗劑被證明可增加食物的攝入量[21]。本研究結(jié)果顯示肝臟中CCK1R表達(dá)隨著膳食脂肪濃度的增加而逐漸降低，這與IR結(jié)果具有一致性，可能提示肝臟CCK1R 和IR 表達(dá)水平均與脂肪濃度密切相關(guān)，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。胰島素和CCK 在生理情況下對肝脂肪代謝有協(xié)同作用，而病理情況下則相互影響以適應(yīng)肥胖導(dǎo)致的變化[3,10]。本研究同時檢測肝IR 和CCKR，發(fā)現(xiàn)二者均隨脂肪濃度的增加逐漸降低，這為臨床上通過肝IR 和CCK1R 制定新的藥物靶點(diǎn)來預(yù)防肥胖癥和相關(guān)肝病提供了數(shù)據(jù)支持。

綜上所述，肥胖癥作為全身性疾病，能同步降低肝臟IR 和CCK1R 以及增加胰腺胰島素儲量。但在肥胖條件下，腸-胰軸中胰島素和CCK 間的相關(guān)作用機(jī)制仍有待深入研究。本研究的新穎性在于：（1）同時檢測肝IR 和CCKR 表達(dá)水平。（2）用外周血和門靜脈血胰島素水平反映胰島素敏感性。從這一模型中得到的結(jié)果，如HFD 可同時下調(diào)肝IR和CCKR 表達(dá)等，也將會對肥胖癥和肝病的相關(guān)研究產(chǎn)生影響。