長(zhǎng)鏈非編碼RNA（AC073934.6）慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建及其對(duì)HEY 和HeLa 細(xì)胞系SND1 表達(dá)的影響

扈利紅，邱寶晨，辛靈彪，張緯

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津300070）

非編碼RNA（non-coding RNAs，ncRNAs）是一種不編碼蛋白質(zhì)的RNA，通常按照其核苷酸的數(shù)量分為兩類，其中長(zhǎng)度小于200個(gè)核苷酸的稱為小ncRNAs，包括微小RNAs（miRNAs）、短干擾RNAs（siRNAs）和小核仁RNAs（snoRNAs）等，而長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的則稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs 在胞核和胞漿里均有功能[1]。在胞核里lncRNA 可以起到招募轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白并識(shí)別DNA 的作用；在胞漿里通過吸附小miRNAs避免其與mRNA 結(jié)合，進(jìn)而間接影響mRNA 的穩(wěn)定性[2]。因此lncRNA 可以參與許多的生命活動(dòng)以及疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-5]。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA AC073934.6（lncRNA-AC）是最近被鑒定出的一個(gè)不編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。它位于人的7 號(hào)染色體q32.1 區(qū)，長(zhǎng)7328 bp，包含3個(gè)長(zhǎng)度分別為340 bp、112 bp、43 bp 的外顯子，但目前尚沒有對(duì)其功能的研究。SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白是一個(gè)保守的多功能蛋白，前期的研究已表明，SND1 在基因轉(zhuǎn)錄、mRNA 剪切、mRNA 穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用，進(jìn)而參與細(xì)胞分化和腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6-10]。近期研究發(fā)現(xiàn)SND1 在卵巢癌中高表達(dá)，并能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[11]。但目前為止，對(duì)于SND1 本身的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。LncRNA-AC 與SND1 基因在基因組上的位置靠近，因此lncRNA-AC 可能會(huì)通過調(diào)控SND1 進(jìn)而參與腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究利用同源重組的方法構(gòu)建了真核pLVX-lncRNA-AC重組質(zhì)粒，并在HEY 和HeLa 兩種細(xì)胞系中成功表達(dá)，探討lncRNA-AC 與SND1 的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 慢病毒質(zhì)粒載體pLVX-IRESPuro、包裝質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2 由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系石磊教授饋贈(zèng)；DH5α 感受態(tài)大腸桿菌E.coli（BC102）購自博邁德生物公司；人腎上皮細(xì)胞293T、人卵巢癌細(xì)胞HEY、人宮頸癌細(xì)胞Hela 均來自本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶XhoⅠ（FD0694）和XbaⅠ（FD0684）、BCA 蛋白測(cè)定試劑盒（#SA242678）、revert aid first strand cDNA synthesis kit（K1622）均購自Thermo Fisher Scientific 公司；primestar? max DNA polymerase（R045A） 和primestar?gxl DNA polymerase（R050Q）購于Takara 公司；genbuildertmcloningkit（L00701）購自GenScript；去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（PD1222-01）購自Biomiga；DNA 快速凝膠回收試劑盒（28704）購自QIAGEN；tripureisolationreagent（11667165001）購自Roche；trans 2K DNA marker（BM101-01）購于北京全式金公司。多克隆鼠源抗SN4 抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠源IgG 二抗（120495）購自KPL；LumiGLo化學(xué)發(fā)光底物（D0018-2）購自碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫查找lncRNA-AC 與SND1 在基因組上的位置關(guān)系 打開UCSC 數(shù)據(jù)庫（http://genome.ucsc.edu/）搜索SND1 與lncRNA-AC 的位置關(guān)系。

1.2.2 目的片段的獲取 收集1×106個(gè)卵巢癌細(xì)胞HEY，提取細(xì)胞基因組DNA。根據(jù)lncRNA-AC 以及真核表達(dá)質(zhì)粒pLVX-IRES-Puro 的基因序列，設(shè)計(jì)出針對(duì)lncRNA-AC exon1 和exon2 的引物（F1+R1、F2+R2），并將化學(xué)合成的第3個(gè)外顯子作為引物（F3+R3）（表1），引物由金唯智生物科技有限公司合成。利用同源重組的方法（圖1），以基因組DNA為模板，F(xiàn)1+R1 為引物，擴(kuò)增出含第1個(gè)外顯子的DNA 片段（F1R1）；同時(shí)，通過巢式PCR 獲得第2個(gè)外顯子，首先以F2+R3 為引物，擴(kuò)增出lncRNA-AC中包括第2個(gè)和第3個(gè)外顯子的DNA 片段（F2R3），再以F2R3 為模板，F(xiàn)2+R2 為引物，擴(kuò)增出含第2個(gè)外顯子的DNA 片段（F2R2）。然后將化學(xué)合成的第3個(gè)外顯子的DNA 片段（F3R3）單鏈經(jīng)過退火變成雙鏈。利用重疊延伸PCR，以上述3個(gè)DNA 片段為模板，F(xiàn)1+R3 為引物，獲得目的基因（F1R3）。

1.2.3 載體與目的基因的體外連接及陽性克隆的鑒定 使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取pLVXIRES-Puro 載體，進(jìn)行XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，膠回收酶切產(chǎn)物，把酶切產(chǎn)物和目的片段進(jìn)行同源重組。同源重組的總反應(yīng)體系是20 μL，加入目的基因、線性化的載體、同源重組試劑GenBuilder 2× Master Mix 和ddH2O。反應(yīng)條件是50℃連接15 min。

表1 LncRNA-AC 的引物序列Tab 1 Primer sequences for lncRNA-AC

圖1 LncRNA-AC 質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig 1 Schematic diagram of lncRNA-AC plasmid construction

重組后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，將菌液涂在含氨芐青霉素的LB 平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，用F1+R3 引物做菌落PCR，篩選在525 bp 左右有條帶的陽性菌落，大量培養(yǎng)，一部分菌液送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，另一部分提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 HEY、HeLa 細(xì)胞lncRNA-AC 穩(wěn)定株的構(gòu)建及鑒定 包裝質(zhì)粒pMD2.G、包裝質(zhì)粒psPAX2 與重組質(zhì)粒按照3.95 μg：7.3 μg：11.25 μg 混勻，利用聚乙烯亞胺（PEI）共轉(zhuǎn)染至融合率為70%的293T 細(xì)胞中，分別在24 h、48 h 收集病毒液并用0.45 μm濾器過濾。

待HEY、HeLa 細(xì)胞的融合率達(dá)到60%，加入9 mL病毒液，1 mL 胎牛血清和75 μg polybrene。感染48 h后更換新培養(yǎng)基并加入1 μg/mL 嘌呤霉素進(jìn)行篩選，陽性細(xì)胞即為穩(wěn)定株。取1×106穩(wěn)定株細(xì)胞，用TRIzol 法提取總RNA，分別取3 μg 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PCR 法檢測(cè)lncRNA-AC 的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SND1 的mRNA 水平，引物如下（表2）。同時(shí)用10 cm 皿培養(yǎng)細(xì)胞，隨后提取總蛋白檢測(cè)蛋白濃度，經(jīng)8%SDS-PAGE，檢測(cè)感染lncRNA-AC 之后SND1蛋白水平變化情況。

表2 LncRNA-AC 和SND1 的qPCR 引物序列Tab 2 qPCR Primer sequences for lncRNA-AC and SND1

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s 表示，組間比較采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA-AC與SND1在基因組上的位置關(guān)系 通過數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，lncRNA-AC 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和SND1 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之間僅有168 bp，與SND1轉(zhuǎn)錄方向相反，AC073934.6 位于SND1 基因反義鏈（圖2）。

2.2 LncRNA-AC 基因片段獲取 以基因組DNA為模板，成功獲得lncRNA-AC 的基因片段F1R1、F2R2 和F1R3（圖3）。

圖2 LncRNA-AC 和SND1 基因的位置關(guān)系Fig 2 Positional relationship of lncRNA-AC and SND1

圖3 LncRNA-AC 的目的片段Fig 3 Target fragment of lncRNA-AC

2.3 載體與目的基因的體外連接及陽性克隆的鑒定 采用XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切pLVX-IRES-Puro得到線性化的載體，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定及回收（圖4）。

圖4 線性pLVX-IRES-Puro 質(zhì)粒載體的獲取Fig 4 Acquisition of linear pLVX-IRES-Puro plasmid vector

菌落PCR 結(jié)果顯示，1 號(hào)克隆含有陽性重組質(zhì)粒（圖5）。測(cè)序結(jié)果顯示重組質(zhì)粒的序列與lncRNA-AC 序列完全一致（圖6）。這些結(jié)果表明pLVXIRES-lncRNA-AC 質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖5 菌落PCR 篩選陽性重組體Fig 5 Bacterial PCR screening for positive recombinants

2.4 HEY、HeLa 細(xì)胞lncRNA-AC 穩(wěn)定株的構(gòu)建及SND1 表達(dá)量的測(cè)定 普通PCR 擴(kuò)增lncRNA-AC，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定lncRNA-AC 在細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)錄（圖7）。

圖6 重組質(zhì)粒lncRNA-AC 的測(cè)序結(jié)果Fig 6 Sequencing results of recombinant plasmid lncRNA-AC

圖7 過表達(dá)lncRNA-AC 穩(wěn)定株的PCR 結(jié)果Fig 7 PCR of lncRNA-AC overexpressing stable strain

在HEY 和HeLa 細(xì)胞中，通過Western 印跡檢測(cè)，lncRNA-AC 的過表達(dá)幾乎不影響SND1 的蛋白質(zhì)水平（圖8A）。同時(shí)，利用實(shí)時(shí)PCR 檢測(cè)了HEY和HeLa 細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 水平。在HEY 細(xì)胞系中，WT 和過表達(dá)lncRNA-AC 后SND1 的mRNA 相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.14 和1.24±0.19，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.761，P=0.07）；在HeLa 細(xì)胞系中，兩者的表達(dá)量分別為1.02±0.09 和0.83±0.13（t=2.081，P=0.14），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖8B）。

圖8 LncRNA-AC 不影響SND1 的表達(dá)Fig 8 LncRNA-AC does not affect the expression of SND1

3 討論

本研究采用了多種PCR 衍生技術(shù)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒lncRNA-AC。為了獲得特異的F2R2，采用了巢式PCR。巢式PCR 的目的是使用兩對(duì)PCR 引物擴(kuò)增特異的片段。第一對(duì)PCR 引物又稱外側(cè)引物，擴(kuò)增相對(duì)大的區(qū)域；第二對(duì)引物稱為巢式引物結(jié)合在第一次PCR 產(chǎn)物內(nèi)部，從而獲得特異性的目的片段。其次，采用了重疊延伸PCR 將lncRNA-AC的3個(gè)外顯子片段（F1R1、F2R2 和F3R3）連接起來。重疊延伸PCR 可作為位點(diǎn)定向突變的手段，為目的基因引入所需的突變[12-13]。最終，通過同源重組的方法把lncRNA-AC 的編碼片段和線性化載體連接起來。同源重組構(gòu)建質(zhì)粒的關(guān)鍵是每個(gè)DNA 片段（包括克隆載體）末端需含有一個(gè)15～40 bp 的共享同源序列作為同源臂，含有相同同源臂的兩個(gè)片段可以在重組酶的作用下特異性連接。因此，同源重組是目前高效快速構(gòu)建質(zhì)粒的策略[14-15]。在本次研究中，通過巢式PCR、重疊延伸PCR 和同源重組法成功構(gòu)建了lncRNA-AC 的慢病毒質(zhì)粒。

LncRNA-AC 與SND1 的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)只相差168 bp，且轉(zhuǎn)錄方向相反，它們共用了一段轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列。但是，在HEY 和HeLa 細(xì)胞中過表達(dá)lncRNA-AC 并不影響SND1 的表達(dá)。提示在卵巢癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA-AC 可能不會(huì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)招募蛋白并結(jié)合至SND1 的啟動(dòng)子去影響SND1 的表達(dá)。LncRNA-AC 在HEY 細(xì)胞和HeLa 細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，但SND1 的表達(dá)量均比較高。這可能是由于lncRNA-AC 與SND1 的轉(zhuǎn)錄方向相反，發(fā)生轉(zhuǎn)錄碰撞，隨后SND1 的轉(zhuǎn)錄活性占主導(dǎo)所致。然而有趣的是，在數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)lncRNA-AC 和SND1 均在肝、垂體和睪丸等中高表達(dá)。提示在肝、垂體和睪丸中可能存在著不同于細(xì)胞系中的組織特異性的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。但是，目前還沒有在小鼠基因組中找到人源lncRNA-AC 的同系轉(zhuǎn)錄本或者轉(zhuǎn)錄類似物。因此需要繼續(xù)在人源的肝細(xì)胞系中探討lncRNAAC 與SND1 的表達(dá)關(guān)系。