沙棘籽蛋白肽對(duì)db/db小鼠降血糖活性及腎臟保護(hù)作用

舒丹陽(yáng),熊 犍,劉鵬展,崔 春

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問(wèn)題,患病人數(shù)一直在上升,預(yù)測(cè)到2045年,約有6.93億糖尿病患者[1]。DM作為一種慢性代謝性疾病以各種方式影響身體健康,身體器官(如腎臟、心臟、眼睛、血管和神經(jīng))的損傷、功能障礙和衰竭。高血糖引起的血管并發(fā)癥造成代謝紊亂、氧化應(yīng)激增加、腎多醇形成、蛋白激酶活化和晚期糖基化終產(chǎn)物的積累和腎小球的損傷[2]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是指糖尿病發(fā)展過(guò)程中引起的腎臟功能紊亂,是一種微血管并發(fā)癥,并最終導(dǎo)致終末期腎病。DN的典型癥狀是細(xì)胞外基質(zhì)增加導(dǎo)致基底膜增厚,腎小球系膜和腎小管間質(zhì)增大,腎小球?yàn)V過(guò)率降低,玻璃體病變和壞死,足細(xì)胞丟失,尿微量白蛋白增加。糖尿病腎病患者的死亡率比無(wú)腎病糖尿病患者高約30倍[3]。因此,DN的防治日益受到重視。

沙棘(HippohaerhamnoidesL.)是一種天然的藥食同源性植物,含有的沙棘多糖、原花青素以及酚酸類(lèi)物質(zhì)均具有顯著的降血糖的活性[4-5]。近年來(lái),越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道了沙棘籽蛋白的降血糖活性。沙棘籽蛋白能夠顯著降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖,提高脂肪酸代謝、降血脂、增加腸道益生菌[6],改善糖尿病引起的細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)[7]。劉洪霞等[8]也驗(yàn)證了沙棘籽蛋白對(duì)于db/db瘦素缺陷型糖尿病小鼠同樣具備顯著的降血糖活性。但是蛋白質(zhì)由于分子量較大,導(dǎo)致功能性較差,降低了其生物利用率。而酶解蛋白質(zhì)一般可以收獲分子量較小和功能性較好的活性多肽[9-12]。例如,袁曉晴等[13]發(fā)現(xiàn)了癩葡萄酶解多肽具有顯著的降血糖活性,而癩葡萄蛋白沒(méi)有這種生物活性。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道沙棘籽蛋白的降血糖活性,沙棘籽蛋白肽(SSPE)的降血糖研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究使用酶解后的沙棘籽蛋白多肽灌胃db/db糖尿病小鼠,通過(guò)測(cè)定體重、血糖值、臟器指數(shù)、肌酐、尿酸、尿素氮和尿蛋白以及腎臟病理切片等指標(biāo)來(lái)探究對(duì)糖尿病小鼠的降血糖效果和腎臟保護(hù)作用,以期為多肽類(lèi)的糖尿病藥物開(kāi)發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12只雄性SPF級(jí)m/m正常小鼠(5周齡)和60只雄性SPF級(jí)db/db糖尿病模型小鼠(5周齡) 購(gòu)于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證編號(hào):2018D046;沙棘籽蛋白肽 實(shí)驗(yàn)室自制;鹽酸二甲雙胍 0.25 g/片,廣州白云山天心制藥股份有限公司;胰酶 10000 U/g,諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司;乙醚(分析純) 廣州芊薈化玻儀器有限公司;96%牛血清蛋白 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;4%多聚甲醛 廣州市化學(xué)試劑廠;無(wú)水乙醇 廣州芊薈化玻儀器有限公司。

ACCU-CHEK Active活力血糖儀 羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司;丙二醛、尿素氮、肌酐、尿酸酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;RT-6500型酶標(biāo)分析儀 上海沛歐分析儀器有限公司;eclipse-e100型光片顯微鏡 日本尼康公司;AL204型電子分析天平 梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司;BJ-500A型中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;GL-21M型高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司;THZ-82型恒溫振蕩器常州國(guó)華電器有限公司;雷磁PHS-3EpH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;152VM4H01C型超低溫醫(yī)用冰箱 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;SCIENTZ-18N型冷凍干燥機(jī) 東莞布魯斯儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘籽蛋白肽的制備 采用此前的沙棘籽蛋白制備工藝[15],取備用的凍干蛋白(蛋白含量80%±2%)采用胰酶進(jìn)行酶解,加酶量0.35%,溫度45 ℃酶解6 h,8000 r/min離心15 min取上清液,凍干得到回收率75.38%、水解度13.55%的沙棘籽蛋白肽。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)小鼠的分組及灌胃處理 對(duì)小鼠進(jìn)行耳號(hào)標(biāo)記,共有6組小鼠,每組12只,進(jìn)行灌胃實(shí)驗(yàn),灌胃時(shí)間為8周,給與普通飼料,飲用水為無(wú)菌純凈水,每次灌胃量均為0.5 mL。

m/m小鼠為正常對(duì)照組(NC),每日灌胃等量生理鹽水。db/db糖尿病模型小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后測(cè)了初始血糖,與正常m/m小鼠相比,均為糖尿病小鼠,符合實(shí)驗(yàn)要求。將db/db小鼠隨機(jī)分為5組:空白對(duì)照組(BC),每日灌胃等量生理鹽水;陽(yáng)性藥物對(duì)照組(PC),每日灌胃300 mg/kg鹽酸二甲雙胍懸浮液;沙棘籽蛋白肽治療組(SSPE),分為低劑量組、中劑量組和高劑量組,分別灌胃50、150和250 mg/kg沙棘籽蛋白肽(該劑量依據(jù)此前沙棘籽蛋白降血糖實(shí)驗(yàn)劑量組所設(shè)定)[8]。

1.2.3 小鼠檢測(cè)指標(biāo)

1.2.3.1 小鼠精神狀態(tài)的觀察以及體重和血糖的測(cè)定 觀察小鼠的生理狀態(tài),毛發(fā)和采食量飲水量和排泄情況,每周測(cè)定小鼠體重,選擇小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后的初始體重,以及灌胃第1、4、8周后的體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠尾靜脈取血,用血糖儀和血糖試紙測(cè)定每周血糖值,選擇小鼠初始隨機(jī)血糖,以及灌胃第1、4、8周后禁食8 h的空腹血糖值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.2 相關(guān)臟器指數(shù)測(cè)定 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行8周后,所有動(dòng)物用乙醚吸入法[14]麻醉,眼球取血放于2 mL離心管中,后脫頸處死實(shí)驗(yàn)鼠,30 min后于4 ℃,3000×g離心10 min,取上層血清。取其腎臟、肝臟、脾臟和心臟稱(chēng)重,后將臟器、血清液氮速凍儲(chǔ)存在-80 ℃下供后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析使用。臟器指數(shù)的計(jì)算公式如下:

1.2.3.3 腎功能相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 治療8周后,收集24 h尿液。以牛血清白蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)樣品,采用Bradford法測(cè)定尿蛋白含量[15]。采用ELISA試劑盒測(cè)定血尿素氮、血清肌酐、血尿酸以及腎組織勻漿中丙二醛的含量。各個(gè)指標(biāo)的測(cè)定方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3.4 腎臟組織病理學(xué)檢查 組織學(xué)分析:取m/m小鼠、db/db空白對(duì)照組和各治療組小鼠的新鮮腎臟,用4%多聚甲醛溶液固定24 h流水沖洗10 h,乙醇梯度脫水處理,二甲苯對(duì)腎臟組織進(jìn)行透明處理;組織石蠟包埋,切片(4 μm),切片腎組織脫蠟,用HE染色,制備成中性樹(shù)膠封片后用光片顯微鏡進(jìn)行全景掃描。

1.3 數(shù)據(jù)處理

表1 沙棘籽蛋白肽對(duì)臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of SSPE on organ indexes for each group of mice

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠生理狀態(tài)的觀察

NC組小鼠生理精神都處于活躍狀態(tài),采食量和飲水量正常,排泄量正常(此處數(shù)據(jù)在本文中未呈現(xiàn))。BC組采食量和飲水量明顯增多,排泄量大,到實(shí)驗(yàn)中后期出現(xiàn)便秘的情況。行動(dòng)遲緩呆滯,毛發(fā)粗糙,甚至局部掉毛現(xiàn)象,墊料潮濕,須3 d更換一次墊料。PC和SSPE治療組生理狀態(tài)有所改善,毛發(fā)順滑有光澤,墊料較為干燥,7 d更換一次墊料即可。

2.2 沙棘籽蛋白肽對(duì)小鼠體重的影響

由圖1可知,NC組小鼠體重呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì),db/db各組小鼠的初始體重?zé)o顯著性差異。實(shí)驗(yàn)8周后,BC組小鼠體重顯著低于PC和SSPE治療組(P<0.05),SSPE和PC各組間無(wú)顯差異。這一結(jié)果表明,SSPE可有效緩解糖尿病對(duì)小鼠造成的多飲多食多尿,體重增長(zhǎng)緩慢的不良影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉洪霞[8]用沙棘籽蛋白處理的db/db小鼠體重變化趨勢(shì)保持一致,但與Yuan等利用沙棘籽蛋白處理的STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的體重變化有所差別,其結(jié)果是沙棘籽蛋白處理后相較于模型組體重減輕,在一定程度上緩解了糖尿病引起的肥胖癥狀[7]。主要原因可能是實(shí)驗(yàn)原料和動(dòng)物模型構(gòu)建的差異。

圖1 沙棘籽蛋白肽對(duì)小鼠體重的影響Fig.1 The effect of SSPE on the body weights of mice注:*表示與BC組相比有顯著性差異,#表示與PC組相比有顯著性差異,P<0.05；圖2同。

2.3 沙棘籽蛋白對(duì)小鼠血糖的影響

由圖2可知,NC組小鼠血糖值穩(wěn)定在一個(gè)低水平狀態(tài),無(wú)顯著性差異。db/db各組小鼠的初始隨機(jī)血糖都處于較高水平。灌胃1周后PC組降糖效果顯著(P<0.05),BC與SSPE組空腹血糖無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4周BC組血糖持續(xù)上升,PC、SSPE各組血糖顯著下降。干預(yù)8周,SSPE組的血糖值(低中高分別為:19.53、19.94、20.00 mmol/L)顯著低于BC組血糖峰值(29.56 mmol/L)(P<0.05)。SSPE各劑量組與PC組無(wú)顯著性差異。與劉洪霞[8]研究的沙棘籽蛋白降血糖效果相比,SSPE后期未出現(xiàn)SSP后期的血糖返升的情況,說(shuō)明SSPE的降血糖效果可能優(yōu)于沙棘籽蛋白。袁曉晴等[13]研究的癩葡萄蛋白無(wú)降血糖活性,但酶水解后可以顯著降低糖尿病小鼠血糖。由此可以推測(cè)酶水解提高了SSPE的降血糖活性,因此酶解得到的SSPE的降血糖效果優(yōu)于沙棘籽蛋白。

圖2 沙棘籽蛋白肽對(duì)小鼠血糖的影響Fig.2 The effect of SSPE on the glucose values of mice

2.4 沙棘籽蛋白肽對(duì)臟器指數(shù)的影響

測(cè)定小鼠臟器指數(shù)有助于評(píng)估SSPE對(duì)糖尿病小鼠的降血糖活性[16]。由表1可知,NC組小鼠各臟器指標(biāo)均顯著低于BC組(P<0.05),表明糖尿病已經(jīng)造成db/db小鼠不同程度的臟器病變。PC組和SSPE組的腎臟指數(shù)均顯著低于BC組(P<0.05)。近年來(lái),多肽對(duì)動(dòng)物臟器的保護(hù)效果逐漸被發(fā)現(xiàn)。張明艷[17]發(fā)現(xiàn)油菜籽抗氧化活性肽具備顯著的抗糖尿病腎臟纖維化的效果。肝臟和脾臟指數(shù)變化趨勢(shì)與腎臟指數(shù)變化趨勢(shì)相似,龐佳楠[18]研究的酪蛋白抗氧化肽對(duì)肝細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用。

表2 沙棘籽蛋白肽對(duì)腎臟相關(guān)血清指標(biāo)的影響Table 2 Effect of SSPE on the kidney related biomarkers

在心臟指數(shù)方面,BC與SSPE各組間無(wú)明顯差異,表明SSPE對(duì)糖尿病小鼠心臟保護(hù)作用不明顯。上述結(jié)果表明SSPE對(duì)糖尿病小鼠的腎、肝、脾具有保護(hù)作用。這是因?yàn)榛钚噪目梢詼p少氧化應(yīng)激和炎癥因子,減少TGF-β1的生成,抑制MAPK和核轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)信號(hào)通路,從而對(duì)臟器細(xì)胞起到保護(hù)作用,這與文獻(xiàn)[19-20]報(bào)道的類(lèi)似。

2.5 沙棘籽蛋白肽對(duì)腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響

圖3 腎臟病理切片(400×)Fig.3 Histological examination of the renal tissues(H&E stained)(400×)注：細(xì)箭頭所指區(qū)域?yàn)槟I小囊，粗箭頭箭頭所指區(qū)域?yàn)榛啄ぁ?/p>

腎臟丙二醛是脂質(zhì)過(guò)氧化物,糖尿病患者體內(nèi)自由基過(guò)多,氧化反應(yīng)劇烈,丙二醛含量較高,是腎臟損傷的指標(biāo)之一[21]。由表2可知,NC組各項(xiàng)指標(biāo)都處于較低水平,顯著低于BC組(P<0.05)。SSPE各個(gè)劑量組和PC的腎臟丙二醛含量與BC組無(wú)顯著性差異,由此可以推測(cè),SSPE抑制丙二醛的效果不顯著,不同蛋白酶作用位點(diǎn)不同,故其水解產(chǎn)物的抗氧化性也有所差別[22-23]。肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白需要經(jīng)過(guò)腎臟代謝[24],當(dāng)腎臟毛細(xì)血管受到損傷,腎小球?yàn)V過(guò)率下降,通透性增加,這些腎臟相關(guān)指標(biāo)都會(huì)升高[25]。SSPE組的肌酐、尿素氮、尿酸、尿蛋白顯著低于BC組(P<0.05),此外,SSPE組的血清肌酐、血清尿酸也顯著低于PC組(P<0.05),由此推測(cè)是二甲雙胍作為藥物對(duì)腎臟造成了一定的負(fù)擔(dān)[26]。田穎剛等[27]研究了絲羽烏骨雞活性肽能夠顯著改善因順鉑引發(fā)的腎組織氧化損傷和腎小管壞死。研究表明胰島β細(xì)胞分泌的連接肽作為輔助降血糖的活性肽可以逆轉(zhuǎn)糖尿病腎病初期癥狀,顯著改善腎小球?yàn)V過(guò)率[28]。由此可以推測(cè),SSPE在具備顯著的降血糖效果的同時(shí)可以顯著改善腎小球?yàn)V過(guò)情況,對(duì)腎臟具有一定的保護(hù)作用。

2.6 沙棘籽蛋白肽對(duì)糖尿病小鼠腎臟病理形態(tài)的影響

由圖3可知,使用HE進(jìn)行的組織學(xué)分析,NC組正常小鼠血細(xì)胞分布均勻,腎小球、腎小囊正常無(wú)明顯的病理改變;BC組血細(xì)胞分布凌亂,腎小囊擠壓性萎縮,基底膜增厚,系膜區(qū)變寬,這些都是糖尿病腎病的典型病理癥狀[29]。SSPE治療可明顯改善上述病變癥狀得到改善,說(shuō)明SSPE對(duì)腎臟起到了一定程度的保護(hù)作用,各劑量組間無(wú)顯著性差異。腎臟病理切片結(jié)果與上文中的血清、腎臟和尿液參數(shù)結(jié)果一致。推測(cè)可能是SSPE顯著的降血糖活性,減少ROS,從而降低了膠原蛋白變性導(dǎo)致的基底膜增厚和細(xì)胞間基質(zhì)沉積[19]。

3 結(jié)論

沙棘籽蛋白肽可以顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平,緩解糖尿病引起的腎小球?yàn)V過(guò)率下降,通透性增加和減輕脂質(zhì)過(guò)氧化,并且改善腎小球肥大,基底膜增厚,腎小囊萎縮等癥狀。因此,沙棘籽蛋白肽將來(lái)可用于糖尿病的輔助治療。但本論文尚未對(duì)沙棘籽蛋白肽進(jìn)行分離純化,并且其對(duì)腎臟保護(hù)作用的具體機(jī)理也不清楚,這都需要在將來(lái)深入探究。