滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物降解規(guī)律分析及膳食暴露評(píng)估

林 濤,彭麗媛,陳興連,劉興勇,李茂萱,徐祎然,鄒艷虹,劉宏程,*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所,云南昆明 650205; 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(昆明),云南昆明 650205; 3.云南省臨滄市鳳慶縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)站,云南鳳慶 675900; 4.云南省昆明市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,云南昆明 650033)

紅茶作為我國(guó)的傳統(tǒng)飲用植物之一,屬全發(fā)酵茶,經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等系列工藝加工而成[1]。滇紅茶作為云南省紅茶的代表,在全國(guó)甚至世界上都享有盛譽(yù),也是我國(guó)茶葉出口中的主要種類之一[2]。農(nóng)藥殘留一直是茶葉質(zhì)量安全重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象,近年來,紅茶中的農(nóng)藥殘留也不斷引起社會(huì)的廣泛關(guān)注[3-5],而紅茶因其加工工藝相對(duì)簡(jiǎn)單,相關(guān)的農(nóng)藥在其加工過程中的殘留變化規(guī)律目前尚不明確,缺乏必要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

目前,紅茶中使用的農(nóng)藥種類較多,但是我國(guó)的限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2019[6]中只針對(duì)茶葉中的苯醚甲環(huán)唑、吡蟲啉、噠螨靈、啶蟲脒、多菌靈等65種農(nóng)藥殘留進(jìn)行了規(guī)定,遠(yuǎn)小于紅茶中檢出的農(nóng)藥種類。氟蟲腈作為苯基吡唑類殺蟲劑的代表,具有廣譜殺蟲效果,其對(duì)水生生物以及蜜蜂具有一定的毒性,我國(guó)農(nóng)業(yè)部已于2009年禁止其用于茶葉及蔬菜水果的種植過程中[7],然而,根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室近年來對(duì)于紅茶的監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)顯示,紅茶中的氟蟲腈在近年來時(shí)有檢出,但其來源不明,可能為隱性農(nóng)藥添加或者其在土壤長(zhǎng)期殘留后隨茶樹的代謝進(jìn)入其葉片中,且在紅茶加工過程中的殘留降解變化規(guī)律不明確,需進(jìn)一步系統(tǒng)研究。

基于此,本研究以滇紅茶為研究對(duì)象,通過對(duì)葉片外源噴灑氟蟲腈及其代謝物,采摘后監(jiān)測(cè)其加工過程中氟蟲腈及其代謝物的殘留變化,并基于其中的氟蟲腈及其代謝物殘留量,對(duì)其降解變化規(guī)律及膳食評(píng)估進(jìn)行研究,為科學(xué)引導(dǎo)消費(fèi)和農(nóng)藥的科學(xué)評(píng)估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滇紅茶茶樹(大葉種) 云南省臨滄市鳳慶縣;Cleanert TPT固相萃取柱 天津博納艾杰爾科技有限公司;氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1000 μg/mL) 農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;甲醇、乙腈(色譜純) 德國(guó)merck公司;甲苯(優(yōu)級(jí)純)、氯化鈉(分析純)、無水硫酸鈉(分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)。

API 5500 Q TRAP三重四極桿質(zhì)譜儀 美國(guó)AB SCIEX公司;1290Ⅱ型超高效液相色譜儀、ZORBAX RRHD C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.8 μm) 美國(guó)Agilent公司;AE-100型電子分析天平 瑞士METTLER TOLEDO公司;渦旋振蕩器 美國(guó)Thermo Scientific公司;TGL-15B型高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;HY-5型回旋式振蕩儀 江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 氟蟲腈及其代謝物測(cè)定

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確吸取1.00 mL氟蟲腈及其3種代謝物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇稀釋成濃度為10.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再準(zhǔn)確量取一定體積的氟蟲腈及其3種代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇稀釋得到0.100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,于-20 ℃下保存。

1.2.1.2 色譜條件 采用甲醇和水溶液作為流動(dòng)相,流速:0.20 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:1.00 μL,梯度洗脫參數(shù)見表1。

表1 梯度洗脫參數(shù)Table 1 The parameters of gradient elution

1.2.1.3 質(zhì)譜條件 采用ESI源,負(fù)離子掃描;MRM監(jiān)測(cè)模式。相關(guān)氣體條件為:GS1霧化氣55 L/h;GS2輔助加熱氣55 L/h;氣簾氣20 L/h;噴霧電壓-5500 V;輔助加熱氣溫度550 ℃;氟蟲腈及其代謝物的離子對(duì)條件如表2所示。

1.2.1.4 樣品制備 滇紅茶的加工方法參照NY/T 780-2004(紅茶)[8],滇紅茶鮮葉以及經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵3個(gè)加工工序得到的半成品樣品中含水量較大,故按照鮮樣進(jìn)行樣品制樣,即將所取樣品經(jīng)勻漿機(jī)勻漿后待測(cè);滇紅茶經(jīng)曬干后的樣品因其含水量較低,故直接經(jīng)粉碎機(jī)粉碎,過0.3 mm篩,待測(cè)。

1.2.1.5 樣品前處理 參照文獻(xiàn)[9-10]中的步驟并做適當(dāng)改進(jìn),根據(jù)滇紅茶加工過程中不同工序中含水量的不同,分別稱取5.00 g樣品于50 mL離心管中,鮮葉以及經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵3個(gè)加工工序得到的半成品樣品加入5.00 mL純凈水,而滇紅茶經(jīng)曬干后的樣品中加入10.0 mL純凈水,渦旋振蕩1.00 min,再靜置10.0 min后加入20.0 mL乙腈,利用高速勻漿機(jī)12000 r/min充分勻漿2.00 min,再加入2.00 g氯化鈉,渦旋振蕩5.00 min,在5000 r/min下離心5.00 min,取上清液5.00 mL,待凈化。

表2 氟蟲腈及其代謝物的離子對(duì)條件及相關(guān)參數(shù)Table 2 Ion pair conditions and related parameters for determination of fipronil and its metabolites

1.2.1.6 樣品凈化 滇紅茶樣品基質(zhì)復(fù)雜,易對(duì)測(cè)定儀器造成污染,故本試驗(yàn)中采用TPT固相萃取柱參照文獻(xiàn)[11-12]的方法對(duì)滇紅茶提取溶液進(jìn)行凈化,首先用乙腈-甲苯(3∶1)5.00 mL活化TPT固相萃取柱,樣品提取液5.00 mL上樣后,10.0 mL乙腈-甲苯(3∶1)洗脫,洗脫液40 ℃氮?dú)庠谙麓蹈珊?.00 mL甲醇定容,過濾膜待分析。

1.2.2 氟蟲腈及其代謝物殘留降解試驗(yàn) 選擇晴朗的天氣進(jìn)行殘留試驗(yàn),試驗(yàn)當(dāng)天風(fēng)速為1.2 m/s,氣溫為23.5 ℃,噴灑時(shí)間為下午14點(diǎn)左右,選取10株生長(zhǎng)狀況良好的滇紅茶茶樹,在其鮮葉上噴灑經(jīng)水溶液稀釋的氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜混合溶液,濃度均為2 μg/mL,共噴灑200 mL,噴灑后24 h采摘,采摘方法參照NY/T 788-2018(農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則)[13],采摘量約為5 kg,其后分別于滇紅茶加工過程的萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥4個(gè)工序后取樣,每個(gè)工序取樣200 g,并設(shè)置3個(gè)平行,取樣后及時(shí)于-20 ℃冰箱中保存,待制樣和測(cè)定。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組,對(duì)照組不噴灑農(nóng)藥,其他操作與試驗(yàn)組相同。通過測(cè)定鮮葉及萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥4個(gè)工序中氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜的含量,結(jié)合每一工序中樣品的含水量測(cè)定(測(cè)定方法參照GB 5009.3-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定[13]),統(tǒng)一換算為干樣中氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜含量,計(jì)算降解率,降解率計(jì)算方法為:(樣品原始濃度-每次所得含量)/樣品原始濃度,尋找各農(nóng)藥在加工過程中的降解變化規(guī)律。

1.2.3 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評(píng)估

1.2.3.1 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的各化合物的單一危害 參照文獻(xiàn)[14-16]中的評(píng)估方法,計(jì)算各化合物的危害商HQ,當(dāng)HQ計(jì)算結(jié)果>1時(shí),則表明膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較大,反之當(dāng)HQ<1時(shí),則表明膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低。HQ的具體計(jì)算方法如下:

其中,殘留量采用滇紅茶最終產(chǎn)品中的氟蟲腈及其代謝物含量(mg/kg),參照文獻(xiàn)[17]及國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估委員會(huì)的規(guī)定,平均膳食量按13 g/d計(jì)算,平均體重按60 kg計(jì)算,ADI(mg/kg·bw)采用《GB 2763-2019 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[6]中的數(shù)據(jù)為0.0002 mg/kg·bw。

1.2.3.2 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的總危害 采用各化合物的危害指數(shù)(HI)進(jìn)行評(píng)估,同樣,當(dāng)HI>1時(shí),則表明總的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較大,反之當(dāng)HI<1時(shí),則表明總的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低。HI的計(jì)算方法如下:

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用AB analyst分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的分析,其他的試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel軟件進(jìn)行相關(guān)的統(tǒng)計(jì)分析,同時(shí)繪制相應(yīng)的線性范圍工作曲線等。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件是超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中最關(guān)鍵的一個(gè)條件,氟蟲腈及其代謝物在正負(fù)離子模式下都有一定的響應(yīng),相關(guān)文獻(xiàn)中也有報(bào)道[18-20]。本試驗(yàn)中參考相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道,同時(shí)根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室儀器的實(shí)際情況,分別比較了正負(fù)離子下氟蟲腈及其代謝物的響應(yīng)情況,結(jié)果表明,氟蟲腈及其代謝物在負(fù)離子模式下具有較強(qiáng)的響應(yīng),因其化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有的氨基結(jié)構(gòu),在水溶液環(huán)境中,氨基中的N原子上的孤對(duì)電子易與外界環(huán)境中的H+結(jié)合后呈堿性,一般情況下,堿性化合物易在負(fù)離子模式下電離,因此,本試驗(yàn)中選擇負(fù)離子模式對(duì)氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)也對(duì)相關(guān)的離子對(duì)組合和電壓等相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如表2所示。

一般情況下,在正離子模式下,流動(dòng)相中加入甲酸、乙酸銨等可提高正離子化效率,負(fù)離子模式下加入氨水以提高pH可以提高負(fù)離子效率[21-22],針對(duì)氟蟲腈及其代謝物的化學(xué)結(jié)構(gòu),其在C18色譜柱上的保留較好,采用甲醇-水作為流動(dòng)相能夠達(dá)到較好的分離效果,無拖尾及寬峰現(xiàn)象,而氨水的加入對(duì)于氟蟲腈及其代謝物的離子化效率并未明顯增強(qiáng)。因此,本試驗(yàn)采用負(fù)離子模式,選擇甲醇-水作為流動(dòng)相,且無須在流動(dòng)相中加入銨鹽或者酸性化合物。因氟蟲腈及其代謝物的極性偏小,故試驗(yàn)組選擇甲醇的初始梯度為65%,采用梯度洗脫的方式,氟蟲腈及其代謝物得到了較好的分離,峰形較好,結(jié)果如圖1所示。

圖1 氟蟲腈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)的提取離子對(duì)色譜圖(濃度50 ng/mL)Fig.1 Standard chromatogram of extracted ion pair chromatograms of fipronil and its metabolites(concentration of 50 ng/mL)注:A、B、C和D分別為氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈砜和氟蟲腈亞砜。

表3 氟蟲腈及其代謝物的線性范圍、決定系數(shù)(R2)、檢出限和定量限Table 3 Linear ranges,determination coefficients(R2),limits of detection(LODs)and limits of quantitation(LOQs)of fipronil and its metabolites

2.2 氟蟲腈及其代謝物測(cè)定方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍和靈敏度 將氟蟲腈及其代謝物分別用甲醇稀釋成不同的濃度,分別進(jìn)樣,進(jìn)行線性回歸,得到其線性范圍并計(jì)算相關(guān)系數(shù);同時(shí)利用滇紅茶空白樣品基質(zhì),分別添加不同濃度的氟蟲腈及其代謝物,通過不斷地降低所添加的氟蟲腈及其代謝物濃度,直至其出峰達(dá)到3倍和10倍信噪比(S/N),所對(duì)應(yīng)的加標(biāo)濃度即為其檢出限和定量限。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,氟蟲腈及其代謝物在0.5～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,R2大于0.9991,檢出限為0.4 μg/kg,定量限為1.5 μg/kg。

表4 氟蟲腈及其代謝物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 Table 4 Recoveries and relative standard deviations of fipronil and its metabolites

本研究中采用了茶葉凈化專用柱TPT小柱,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,極大地提高了檢測(cè)靈敏度,達(dá)到了痕量檢測(cè)的要求。

2.2.2 回收率和精密度測(cè)定 以市場(chǎng)上銷售的滇紅茶作為試驗(yàn)對(duì)象,根據(jù)氟蟲腈及其代謝物的定量限,分別以1倍、5倍和10倍定量限作為添加濃度進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)添加濃度做6次平行試驗(yàn)。結(jié)果如表4所示,不同添加濃度下氟蟲腈及其代謝物的回收率范圍為84.4%～95.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為4.8%～7.4%,符合農(nóng)藥殘留測(cè)定的要求。

2.3 滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物降解變化規(guī)律

分別對(duì)滇紅茶加工過程的每個(gè)主要步驟中取樣,進(jìn)行氟蟲腈及其代謝物的測(cè)定,為保證測(cè)定結(jié)果的一致性和可比性,通過對(duì)每個(gè)步驟中取樣的含水量進(jìn)行測(cè)定,將測(cè)定結(jié)果換算并以干樣計(jì)算,測(cè)定結(jié)果如表5所示,通過對(duì)各個(gè)步驟中的氟蟲腈及其代謝物進(jìn)行降解折線圖的繪制,結(jié)果表明,氟蟲腈及其代謝物的初始含量大致相同,且隨著加工步驟的增多而呈現(xiàn)出含量不斷降低的趨勢(shì),且降解速率類似,經(jīng)揉捻后的滇紅茶樣品中的氟蟲腈及其代謝物呈現(xiàn)出明顯降低的趨勢(shì),其降解率為37.5%～41.2%,隨后經(jīng)發(fā)酵步驟后的滇紅茶中的氟蟲腈及其代謝物的含量變化較小,而經(jīng)干燥后的滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的含量又明顯降低,氟蟲腈及其代謝物經(jīng)過滇紅茶的加工過程后的最終降解率為65.1%～70.1%,初步表明,揉捻和干燥兩個(gè)步驟中氟蟲腈及其代謝物能夠大量地降解,推測(cè)原因可能為揉捻和干燥兩個(gè)步驟中的溫度較高,高溫下易引起氟蟲腈及其代謝物的降解,該結(jié)論與李棟等[23-26]所述一致。

表5 滇紅茶加工過程中氟蟲腈及其代謝物含量Table 5 Content of fipronil and its metabolites during processing of black tea

表6 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評(píng)估Table 6 Dietary evaluation of fipronil and its metabolites in black tea

2.4 滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物膳食評(píng)估

根據(jù)HQ和HI的計(jì)算公式,以滇紅茶中的氟蟲腈及其代謝物最終含量分別計(jì)算相關(guān)的危害因子,膳食評(píng)估結(jié)果如表6所示,氟蟲腈及其代謝物的各HQ值均小于1,表明滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低;而氟蟲腈及其代謝物的總危害指數(shù)HI為2.175,大于1,表明膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)不可接受,但是該情況是在較大的施藥量的條件下,即極端條件下的單種農(nóng)藥的計(jì)算值表明膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)可接受,同時(shí)目前市場(chǎng)上只有氟蟲腈農(nóng)藥售賣,其余3種為氟蟲腈的代謝物,滇紅茶實(shí)際生產(chǎn)中不可能同時(shí)違禁使用4種氟蟲腈類化合物。因此,鑒于氟蟲腈及其代謝物已在茶葉中禁止使用,結(jié)合滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低,但也應(yīng)引起重視。

3 結(jié)論

利用TPT凈化小柱,結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,建立了滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的高靈敏度快速測(cè)定方法,在負(fù)離子MRM監(jiān)測(cè)模式下,氟蟲腈及其代謝物在0.5～100 μg/mL的濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系較好,最低檢出限為0.4 μg/kg,3個(gè)添加濃度下的回收率范圍為84.4%～95.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為4.8%～7.4%,可滿足滇紅茶中痕量氟蟲腈及其代謝物殘留檢測(cè)的要求。本研究以滇紅茶為研究對(duì)象,通過在茶樹鮮葉上噴灑氟蟲腈及其代謝物后采摘,對(duì)滇紅茶加工過程的每個(gè)主要步驟中進(jìn)行取樣并測(cè)定氟蟲腈及其代謝物含量,結(jié)果表明,氟蟲腈及其代謝物含量在滇紅茶加工過程中隨加工步驟的增多而不斷降低,揉捻和干燥兩個(gè)步驟中氟蟲腈及其代謝物能夠大量地降解;根據(jù)最終滇紅茶產(chǎn)品中氟蟲腈及其代謝物的含量,計(jì)算HQ和HI結(jié)果表明,氟蟲腈及其代謝物的各HQ值均小于1,膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低,而氟蟲腈及其代謝物的總危害指數(shù)HI大于1,膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)不可接受,但是鑒于氟蟲腈及其代謝物已在茶葉中禁止使用,結(jié)合滇紅茶中氟蟲腈及其代謝物的HQ和HI值,初步表明其膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)較低。

本研究中所用的危害商HQ主要是基于ADI、平均體重和膳食量進(jìn)行評(píng)估的,主要是基于已有的相關(guān)數(shù)據(jù)和田間試驗(yàn)的殘留值所得,但是在實(shí)際情況中不同消費(fèi)群體的體重和膳食量有所差異,而所得的危害商可能也略有不同,在今后的研究中,還需要針對(duì)不同消費(fèi)群體進(jìn)行相應(yīng)的系統(tǒng)評(píng)估,以期得到更加系統(tǒng)全面的評(píng)估結(jié)論。