微膠囊技術(shù)在益生菌CICC 6075冰淇淋中的應(yīng)用

田文靜,趙東瑞,孫玉清,柳 青,羅紅霞,鄧志峰,汪慧華

(1.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系,北京 102442; 2.北京工商大學(xué)食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室,北京 100048)

冰淇淋是一種具有獨(dú)特風(fēng)味和細(xì)膩口感的乳制品,深受消費(fèi)者喜愛。但隨著生活水平的不斷提高,人們對(duì)食品的要求不僅僅是美味,更關(guān)注其在改善人體健康水平以及疾病預(yù)防上的表現(xiàn)。而冰淇淋作為一種低溫儲(chǔ)存的乳制品,是益生菌的理想載體。益生菌冰淇淋同時(shí)結(jié)合了冰淇淋的感官特性和益生菌的營養(yǎng)特性,其口感良好、營養(yǎng)價(jià)值較高,且低溫的儲(chǔ)存環(huán)境對(duì)益生菌的保存十分有利,因而貨架期遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酸奶等乳制品,市場前景廣闊,也引起了越來越多研究者和消費(fèi)者的關(guān)注[1]。Góral等[2]將富鎂乳酸菌添加至冰淇淋中,并對(duì)其理化性質(zhì)和微生物學(xué)特性進(jìn)行探究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),富鎂菌的添加對(duì)冰淇淋的顏色、可溶性、硬度、化學(xué)參數(shù)等均沒有影響,但與對(duì)照組相比,冰淇淋中富鎂菌的存活性較低。

益生菌類食品中所含益生菌需在食品和宿主中達(dá)到一定數(shù)量(通常認(rèn)為在食品中不低于106CFU/g或106CFU/mL)且保持代謝穩(wěn)定才能提供健康功效[3-4]。益生菌進(jìn)入宿主后要發(fā)揮益生作用需對(duì)胃酸和膽汁酸具有抗性、對(duì)粘膜和腸上皮細(xì)胞具有粘附性[5-6]。但是,在食品的實(shí)際生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)、消費(fèi)等過程中,益生菌會(huì)受到食品組分(酸、堿、添加劑等)、加工和儲(chǔ)存條件(冷凍、氧氣等)及宿主消化系統(tǒng)(胃酸、膽汁酸、消化酶)等的不良影響[7]。這些不良因素會(huì)導(dǎo)致益生菌類食品中活菌數(shù)大幅下降,甚至低于其能夠發(fā)揮生理功效的最小閾值[8]。例如,在冰淇淋的制作過程中,快速凝凍等工藝會(huì)損傷菌體細(xì)胞膜,進(jìn)而影響菌的生理功能和代謝活性;此外,攪拌過程充入的空氣對(duì)厭氧菌的生長和活性保持也有不利影響[1]。因此,如何提升益生菌對(duì)不利因素的抗性成為了研究人員關(guān)注的熱點(diǎn)。

微膠囊技術(shù)的出現(xiàn)為以上問題提供了可靠的解決方案。研究表明,利用微膠囊技術(shù)將益生菌包埋在腸溶性壁材中,不僅可以增強(qiáng)菌體對(duì)不良環(huán)境的抵抗性,還能使微膠囊中的益生菌在腸道適宜條件下快速釋放,顯著提高菌體在腸道中的存活率,更好地發(fā)揮益生菌的益生功效[9-10]。Farias等[11]分別將鼠李糖桿菌ASCC 290和干酪乳桿菌ATCC 334的裸菌及以海藻酸鈣-殼聚糖為壁材的微膠囊添加至冰淇淋中,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在模擬胃液中,微膠囊組中兩種菌的存活率分別提高了86.2%和84%,在-18 ℃下貯藏150 d后,微膠囊組中兩種菌的存活率分別提高了73.8%和79.5%。因此,將益生菌微膠囊化后添加至冰淇淋是提高益生菌存活率的一個(gè)有效方法。

本研究研發(fā)一種含益生菌微膠囊的冰淇淋,并通過考察益生菌微膠囊的加入對(duì)冰淇淋的理化性質(zhì)、感官性質(zhì)、耐貯藏性及消化特性的影響,來評(píng)估其可行性,為益生菌冰淇淋的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌CICC 6075 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供;人結(jié)腸癌上皮細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞) 中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基、NaCl、NaOH、凝乳酶(1000 U/g)、CaCO3、冰醋酸、HCl溶液、胃蛋白酶(3000 U/mg)、穩(wěn)定劑 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液、青霉素、鏈霉素 美國Sigma 公司;植物油、牛乳、雀巢淡奶油、白砂糖、蛋黃粉、脫脂乳粉 永輝超市。

LRH-250F恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;eppendorf 5810R高速離心機(jī) 德國艾本德公司;磁力攪拌器 常州國華儀器有限公司;恒溫振蕩器 常州國華儀器有限公司;冰淇淋機(jī) 德瑪仕科技有限公司;METTLER TOLEDO FE-28pH計(jì) 美國梅特勒-托利多公司;UV-2600分光光度計(jì) 島津儀器有限公司;KONICA MINOLTA CM-3700A色差儀 日本柯尼卡美能達(dá)公司;BROOKFIELD CT3質(zhì)構(gòu)儀 美國博勒飛公司;SEM-SU8010掃描電子顯微鏡 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要溶液的配制 解囊液:分別配制濃度為0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和濃度為 0.05 mol/L 的檸檬酸,調(diào)節(jié) pH=7.25,121 ℃滅菌15 min,待用[12]。

模擬胃液:參照Felicio等[13]的方法,用0.5 mol/L的HCl溶液將0.85%的NaCl溶液pH調(diào)節(jié)至2.0,加入3 g/L的胃蛋白酶,最后用0.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾滅菌。

1.2.2 益生菌及微膠囊制備

1.2.2.1 益生菌的準(zhǔn)備 將嗜酸乳桿菌CICC 6075接種于MRS 液體培養(yǎng)基,于37 ℃下活化培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末期,離心收集菌泥(3000 r/min,10 min),用0.85%的無菌生理鹽水清洗2次后,于4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?并通過平板計(jì)數(shù)測其活菌數(shù)。

1.2.2.2 益生菌微膠囊的準(zhǔn)備 以乳蛋白為壁材,用乳化法對(duì)益生菌進(jìn)行包埋,制備方法參考Tian等[14]的方法。具體方法為:將脫脂乳粉溶解于蒸餾水中配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的溶液,在4 ℃下攪拌過夜;取28 g 脫脂乳液加入2.0 g 濃縮菌液和400 μL凝乳酶(100 U/mL),在低溫下(4 ℃)攪拌1 h;隨后,取菌乳混合液10 g 加入1.5 g CaCO3混合均勻后,加入到100 g 葵花油中,在磁力攪拌器的作用下反應(yīng)約15 min,待混合物分散到油相中形成均勻的油包水(W/O)型乳化液,加入100 μL冰醋酸,靜置30 min后,離心(1000 r/min,1 min)、洗滌,收集凝膠顆粒,存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 微膠囊的包埋率及形態(tài)觀察

1.2.3.1 包埋率測定 取制得的微膠囊0.5 g,放入4.5 mL的解囊液中,在恒溫振蕩器中以37 ℃、180 r/min的條件振蕩培養(yǎng)120 min至完全崩解,通過平板計(jì)數(shù)測其活菌數(shù)[15]。

微膠囊包埋率(Microencapsulation efficiency,ME,%)計(jì)算如下:

ME(%)=Q1/Q2×100

式中:Q1指微膠囊中活菌數(shù)量(CFU),為每克濕微膠囊的含菌量(CFU/g)與收集得到的微膠囊總質(zhì)量的乘積(g);Q2指初始活菌數(shù)量(CFU),為每毫升濃縮菌液的含菌量(CFU/mL)與加入的濃縮菌液總體積的乘積(mL)。

1.2.3.2 形態(tài)觀察 為觀察微膠囊的形態(tài),利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)制得的微膠囊進(jìn)行觀察,具體操作參照Matias等[16]的方法:取1 g微膠囊樣品,置于2%戊二醛溶液中固定2 h,用超純水洗滌兩次后,依次用25%、50%、75%、90%、95%、100%的乙醇溶液進(jìn)行脫水,最后用超臨界CO2法進(jìn)行干燥。將干燥后的膜置于鋁樁上,噴射鍍金,用掃描電子顯微鏡進(jìn)行菌體形態(tài)觀察和樣本圖像采集。

1.2.4 冰淇淋的制作及理化性質(zhì)檢測

1.2.4.1 冰淇淋的制作 配制2 L冰淇淋漿液:稱量1.25 L牛奶與150 g奶油混合,再加入50 g脫脂奶粉和部分糖粉(糖粉含量共250 g),混合均勻后,加熱至60 ℃,再加入剩余糖粉和10 g復(fù)合穩(wěn)定劑(明膠∶甘油硬脂酸酯∶瓜爾膠=2∶3∶5),均質(zhì)后進(jìn)行巴氏殺菌(80 ℃,20 s),然后在4 ℃下儲(chǔ)存12 h熟化。

準(zhǔn)確稱取三份上述樣品(均為450 g),第一份不添加外物,作為空白對(duì)照,記為冰淇淋A;第二份加入50 g益生菌菌泥,記為冰淇淋B;第三份加入一定量的益生菌微膠囊,使冰淇淋中的活菌數(shù)與冰淇淋B中相近,記為冰淇淋C;最后分別將樣品混勻,置于4 ℃冰箱進(jìn)行熟化,24 h后加入冰淇淋機(jī)中進(jìn)行攪拌充氣,得到的冰淇淋分裝到50 mL的冰淇淋杯中,于-20 ℃下硬化,儲(chǔ)存待測。

1.2.4.2 色差分析 冰淇淋制好后的第一天,采用色差儀在-18 ℃的條件下對(duì)冰淇淋樣品的色澤進(jìn)行測定。首先分別用黑板和白板對(duì)色差儀進(jìn)行校正,然后對(duì)冰淇淋樣品進(jìn)行測定。每組樣品重復(fù)測定3次,取平均值。

所得到的參數(shù)L*值表示明亮度,a*值為正值時(shí)表示偏紅色,為負(fù)值時(shí)表示偏綠色;b*值為正值時(shí)表示偏黃色,為負(fù)值時(shí)表示偏藍(lán)色[17]。色度(C*)和白色指數(shù)(WI)用以下公式計(jì)算[18]:

C*=(a*2+b*2)1/2

WI=100-[(100-L*)2+a*2+b*2]1/2

1.2.4.3 質(zhì)構(gòu)分析 取儲(chǔ)存在-18 ℃條件下的冰淇淋樣品,利用CT3質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其硬度和粘附度進(jìn)行測定,測定條件為:Normal模式,TA-17探頭,測試前探頭速度為2 mm/s,試驗(yàn)和后試驗(yàn)速度為1 mm/s,穿透距離為25 mm,探頭兩次測試間隔為5.00 s,觸發(fā)類型為自動(dòng),每批樣品在大約-18 ℃的溫度下測定三次。硬度測定為探針穿透時(shí)的峰值壓縮力(g),粘附度測定為退出時(shí)的負(fù)峰值壓縮力(mPa·s)[19]。

1.2.4.4 pH 將上述制得的冰淇淋于-20 ℃條件下儲(chǔ)存150 d,以30 d為間隔取樣,取三組冰淇淋各10 g,用無菌蒸餾水稀釋至20 mL,用pH計(jì)測量各樣品的pH,每個(gè)樣品測三個(gè)平行樣品。

1.2.4.5 膨脹率 冰淇淋膨脹率(overrun,%)的測定參照Rinaldi等[20]的方法,在冰淇淋漿液攪打前后分別量取同等體積的冰淇淋漿液和冰淇淋成品,分別測其質(zhì)量,計(jì)算公式如下:

膨脹率(%)=(M1-M2)/M2×100

式中:M1為同等體積冰淇淋漿液的質(zhì)量,g;M2為同等體積冰淇淋成品的質(zhì)量,g。

1.2.4.6 融化率 冰淇淋的融化特性常用融化率(%)來表示[21],具體方法為:準(zhǔn)確稱取冰淇淋50 g,放置在紗網(wǎng)上于37 ℃恒溫箱中進(jìn)行融化,45 min后測定融化的冰淇淋漿液質(zhì)量,計(jì)算公式如下:

融化率(%)=N1/N2×100

式中:N1為融化的冰淇淋漿液質(zhì)量,g;N2為稱取的冰淇淋質(zhì)量,g。

1.2.4.7 脂肪失穩(wěn)度 脂肪失穩(wěn)度的測定參照Balthazar等[18]的方法,具體方法為:分別稱取10 g冰淇淋漿液和冰淇淋成品,用無菌蒸餾水以1∶500 (V/V)進(jìn)行稀釋,1000 r/min離心10 min后,用分光光度計(jì)在540 nm波長下測定其吸光度,以無菌蒸餾水為空白對(duì)照,脂肪失穩(wěn)度的計(jì)算方法如下:

脂肪失穩(wěn)度=(A1-A2)/A1×100

式中：A1為冰淇淋漿液的吸光度;A2為冰淇淋成品的吸光度。

1.2.5 感官檢驗(yàn) 選取30名年齡為18～25歲的人員組成感官評(píng)價(jià)小組(其中男性16人,女性14人),對(duì)剛制作完成的冰淇淋產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)估,并使用感官評(píng)定量表進(jìn)行評(píng)分。評(píng)價(jià)指標(biāo)選取風(fēng)味和滋味、質(zhì)構(gòu)、顏色和外觀,感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示[22]。

表1 冰淇淋的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of ice cream

1.2.6 冰淇淋的耐貯藏性 將上述制得的冰淇淋于-20 ℃條件下儲(chǔ)存150 d,以30 d為間隔取樣,取三組冰淇淋各5 g,37 ℃條件下放于45 mL解囊液中以180 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩至完全崩解,通過平板計(jì)數(shù)測其活菌數(shù),對(duì)比分析在冰淇淋產(chǎn)品中微膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用。

1.2.7 冰淇淋貯藏過程中益生菌的消化特性檢驗(yàn)

1.2.7.1 耐胃酸性試驗(yàn) 在冰淇淋的貯藏過程中,每隔30 d對(duì)冰淇淋中益生菌的耐胃酸性進(jìn)行一次檢測,具體方法為:分別取三組冰淇淋各5 g,加入45 mL模擬胃液中,37 ℃培養(yǎng)2 h后,取5 mL樣品溶液加至45 mL解囊液中37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h,使菌體完全釋放,從中取1 mL溶液進(jìn)行梯度稀釋,通過平板計(jì)數(shù)測其活菌數(shù),并按下式計(jì)算CICC 6075在胃液中的存活率:

表2 微膠囊的包埋率及粒徑Table 2 The microencapsulation efficiency(ME)and size of microcapsules

在胃液中的存活率(%)=N1/N2×100

式中:N1:經(jīng)胃液處理2 h的冰淇淋中活菌數(shù),CFU/g;N2:相同貯藏時(shí)間的冰淇淋中所含活菌數(shù),CFU/g。

1.2.7.2 體外粘附性試驗(yàn) 參照Balthazar等[23]的方法,將Caco-2細(xì)胞以105cell/孔的濃度加入24孔板中,孔板中為高糖DMEM培養(yǎng)基(含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素),于37 ℃、CO2濃度5%的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)約7～10 d,直至形成融合的單層細(xì)胞。粘附試驗(yàn)前1 d,用不含抗生素(青霉素-鏈霉素)的培養(yǎng)基代替生長培養(yǎng)基,用無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗3次。

分別稱取1 mL冰淇淋B溶液和1 mL解囊后的冰淇淋C溶液,加至Caco-2細(xì)胞融合后的單層細(xì)胞中,在37 ℃、5% CO2的加濕培養(yǎng)箱中孵育2 h。隨后,用PBS徹底沖洗細(xì)胞,以去除剩余的食物顆粒和不粘附的乳酸菌。然后,在每個(gè)孔中加入1 mL胰蛋白酶-EDTA消化液將乳酸菌與Caco-2細(xì)胞進(jìn)行分離。最后,分別從每個(gè)孔吸取1 mL懸浮液,加到9 mL蛋白胨水中,連續(xù)稀釋,用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

為測定冰淇淋在儲(chǔ)存過程中益生菌的粘附性變化,每30 d取一次樣,進(jìn)行體外粘附率的測定,并按下列公式計(jì)算了CICC 6075的粘附率:

粘附率(%)=Y2/Y1×100

式中:Y1:經(jīng)胃液處理2 h的冰淇淋中活菌數(shù),CFU/g;Y2:粘附于Caco-2細(xì)胞的活菌數(shù),CFU/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有獨(dú)立試驗(yàn)至少重復(fù)3次,應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn),試驗(yàn)數(shù)值以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊的包埋率及形態(tài)觀察

微膠囊的包埋率及粒徑大小見表2,由表2可知,以乳蛋白為壁材,采用乳化法對(duì)嗜酸乳桿菌CICC 6075進(jìn)行微膠囊化,其包埋率為84%,表明該方法和壁材與嗜酸乳桿菌CICC 6075的相容性較好。此結(jié)果與Heidebach等[24]的研究結(jié)論一致。

利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)微膠囊的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可以看出,微膠囊顆粒大小均勻,粒徑分布范圍較窄,用光學(xué)顯微鏡圖像分析軟件測量得微膠囊的平均直徑為(145.37±23.64)μm;圖2可以看到微膠囊形狀較規(guī)則、表面致密,為其中的乳桿菌提供了嚴(yán)密的保護(hù)。Fahimdanesh等[25]認(rèn)為,形狀規(guī)則、粒徑較小的微膠囊添加至食品后對(duì)其感官性質(zhì)影響較小,在感官評(píng)價(jià)中一般不影響口感、不會(huì)出現(xiàn)砂礫感。也有研究表明,粒徑為微米級(jí)的膠囊加入食品后能使其產(chǎn)生光滑的質(zhì)地[26]。但并非粒徑越小越好,Rokka等[27]研究發(fā)現(xiàn),粒徑小于100 μm的膠囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用減弱,尤其是在模擬人工胃液中,微膠囊中益生菌的存活率與裸菌相比并無顯著提高。

圖1 光學(xué)顯微鏡下CICC 6075微膠囊的形態(tài)(100×)Fig.1 Morphology of CICC 6075 microcapsules(100×)

圖2 電子顯微鏡下CICC 6075微膠囊的形態(tài)(800×)Fig.2 SEM morphology of CICC 6075 microcapsules(800×)

2.2 益生菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋理化性質(zhì)的影響

為探討益生菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋理化性質(zhì)的影響,對(duì)三種冰淇淋的膨脹率、融化率、脂肪失穩(wěn)度、色差、質(zhì)構(gòu)等理化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(見表3),同時(shí)測定了不同貯藏時(shí)間三種冰淇淋的pH變化(見圖3)。結(jié)果表明,與冰淇淋A相比,冰淇淋B的膨脹率、融化率和脂肪失穩(wěn)度均有所下降,但差異不顯著(P>0.05);而冰淇淋C的三項(xiàng)指標(biāo)均有所上升,可能與微膠囊的加入增加了冰淇淋漿液的黏度有關(guān)[2]。

有研究表明,冰淇淋的理化性質(zhì)與其組成成分及加工過程密切相關(guān),且各性質(zhì)之間也存在一定的相關(guān)性。其中,膨脹率是指在冷凍過程中由于冰淇淋混合物中加入空氣而膨脹的百分比,是冰淇淋的重要物理特性之一,對(duì)產(chǎn)品的質(zhì)量(如質(zhì)地、柔軟度及產(chǎn)品的穩(wěn)定性等)有一定影響[28]。同時(shí),膨脹率也決定了融化速度,冰淇淋B的融化率較低,可能是因?yàn)槠湎鄳?yīng)的膨脹率較低[29]。脂肪失穩(wěn)度可表征脂肪的不穩(wěn)定程度,因?yàn)楸苛苤胁环€(wěn)定的脂肪常以脂肪球團(tuán)的形式存在,而這些脂肪球可以包裹并支撐空氣分子,使其持有一定的膨脹率[30]。所以,脂肪失穩(wěn)度與膨脹率成正相關(guān),本研究中冰淇淋C的脂肪失穩(wěn)度和膨脹率均高于B,符合此論斷。此外,冰淇淋的融化率與其硬度也存在相關(guān)性,通常融化率低的產(chǎn)品相對(duì)硬度較大[28]。本試驗(yàn)的結(jié)果與上述觀點(diǎn)相符,在質(zhì)構(gòu)檢測中發(fā)現(xiàn),冰淇淋B的硬度最大,為(67.86±3.92) g;而冰淇淋C的硬度最小,為(45.31±3.26) g,與相應(yīng)的融化率呈負(fù)相關(guān)。此外,冰淇淋的粘附度也呈現(xiàn)冰淇淋C>冰淇淋A>冰淇淋B的趨勢(shì),這可能與其固形物含量有關(guān)。

表3 益生菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋理化性質(zhì)的影響Table 3 Effects of probiotics and microcapsules addition on physicochemical properties of ice cream

顏色是食品的一個(gè)重要屬性,是消費(fèi)者感知食品的第一特征,顏色的好壞往往影響消費(fèi)者的選擇[31]。表3數(shù)據(jù)顯示,在顏色參數(shù)方面,三種冰淇淋的亮度L*值為93.97±1.25～94.31±0.82,樣品間無顯著差異(P>0.05)。此外,白度是牛乳基產(chǎn)品的一個(gè)重要特征[20]。在本研究中,冰淇淋A呈極白色,CICC 6075裸菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋的顏色參數(shù)影響不顯著(P>0.05)。

由圖3可以看出,在貯藏過程中,CICC 6075微膠囊的添加對(duì)冰淇淋的pH影響并不顯著(P>0.05)。而貯藏150 d冰淇淋B的pH下降了0.39,這可能是由于貯藏過程中嗜酸乳桿菌CICC 6075的代謝產(chǎn)物使冰淇淋的pH降低,而微膠囊將菌包埋在其中,導(dǎo)致菌對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收緩慢、代謝產(chǎn)物釋放減少,故pH下降不顯著[32]。Homayouni等[33]報(bào)道稱,微膠囊化的乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)50 h可使pH降至4,而乳酸菌裸菌僅需要20 h。Abghari等[34]也發(fā)現(xiàn)添加游離鼠李糖乳桿菌會(huì)影響冰淇淋樣品的pH,但對(duì)其物理性質(zhì)沒有影響。這均與本研究的結(jié)論一致。

圖3 冰淇淋貯藏過程中pH的變化Fig.3 Changes in pH of ice cream during storage注:字母不同代表同一產(chǎn)品在不同貯藏時(shí)間下差異顯著(P<0.05)。

2.3 益生菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋感官性質(zhì)的影響

對(duì)三種冰淇淋的感官評(píng)價(jià)結(jié)果見圖4,由圖4可以看出,三種冰淇淋的各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)均沒有顯著差異(P>0.05),表明CICC 6075裸菌及CICC 6075微膠囊的添加對(duì)冰淇淋的口感、質(zhì)地、風(fēng)味、顏色、外觀等感官特性均沒有顯著影響,在評(píng)價(jià)中,沒有任何一個(gè)冰淇淋樣品觀察到不良的味道、蓬松感或砂礫感。原因可能是乳化法制得的微膠囊粒徑較小,不容易被口腔感覺器官識(shí)別,但由擠壓法制得的微膠囊粒徑相對(duì)較大,很可能導(dǎo)致砂礫感[35]。Kataria等[36]也有類似的發(fā)現(xiàn),認(rèn)為益生菌裸菌或微膠囊的添加不會(huì)導(dǎo)致冰淇淋產(chǎn)生不良感官特性。

圖4 三種冰淇淋的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Fig.4 The sensory evaluation results of three ice cream

表4 加工、貯藏及模擬胃液對(duì)三種冰淇淋中CICC 6075活菌數(shù)的影響Table 4 Effects of processing,storage and SGF on the survival of CICC 6075

此外,感官評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),三種冰淇淋都有良好的可接受度。在購買意向測試中,80%的測試者表示可能會(huì)購買含有益生菌微膠囊的冰淇淋,同時(shí),也有很多測試者表示對(duì)功能性冰淇淋的營養(yǎng)價(jià)值及健康功效非常感興趣。因此,本研究指出了含益生菌冷凍甜品的潛在市場。

2.4 冰淇淋的耐貯藏性

貯藏期間,冰淇淋中益生菌的活菌數(shù)能否維持在其發(fā)揮生理功效的最小閾值之上(>106CFU/g)是衡量冰淇淋保健功效的重要指標(biāo)。表4為加工及貯藏過程中冰淇淋B和冰淇淋C中嗜酸乳桿菌CICC 6075的存活情況。結(jié)果表明,冰淇淋的凝凍過程對(duì)菌體的損傷較大,1 h的攪拌凝凍使冰淇淋B中的CICC 6075活菌數(shù)下降了(1.20±0.08)lg CFU/g;在-18 ℃的條件下貯藏150 d后,CICC 6075活菌數(shù)更是顯著下降(P<0.05),從(7.78±0.07)lg CFU/g降至(5.54±0.03)lg CFU/g,低于益生菌發(fā)揮健康功效的最低閾值。原因可能是攪拌過程中機(jī)械力對(duì)菌體造成傷害,或是凝凍過程中溫度迅速降低,水分結(jié)晶形成的機(jī)械力對(duì)益生菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞所致,同時(shí)長時(shí)間暴露在低溫下也會(huì)降低細(xì)胞活性[1]。此外,凝凍攪拌會(huì)使冰淇淋內(nèi)部包含大量空氣,而作為厭氧菌的嗜酸乳桿菌對(duì)氧氣較敏感,因此高溶氧量的環(huán)境也不利于菌體的生長[37]。

然而,凝凍過程中冰淇淋C中的CICC 6075活菌數(shù)變化不顯著(P>0.05),僅下降了(0.09±0.07)lg CFU/g。在-18 ℃的貯藏條件下,冰淇淋C中的CICC 6075也保存較好,150 d后活菌數(shù)僅下降了(0.60±0.08)lg CFU/g,最終活菌數(shù)為(8.09±0.03)lg CFU/g,遠(yuǎn)高于益生菌發(fā)揮健康功效的閾值。原因可能是微膠囊為CICC 6075提供了保護(hù)層,使其與外界環(huán)境隔絕,提高了菌體對(duì)冷凍及氧氣等不適環(huán)境的抗性。Farias等[11]也有類似結(jié)論,以海藻酸鈉-殼聚糖為壁材、利用擠壓法制得的微膠囊對(duì)-18 ℃條件下保護(hù)鼠李糖乳桿菌ASCC 290十分有效。Zanjani等[32]也發(fā)現(xiàn),與裸菌相比,貯藏過程中微膠囊能顯著提高冰淇淋中的干酪乳桿菌ATCC 39392和雙歧桿菌ATCC 15703的活菌數(shù),原因是微膠囊均勻、完整的結(jié)構(gòu)為內(nèi)部的菌體提供了良好的保護(hù)。

2.5 冰淇淋貯藏過程中益生菌的消化特性檢驗(yàn)

2.5.1 耐胃酸性試驗(yàn) 益生菌要想發(fā)揮益生功效,除了需要在產(chǎn)品中保持一定活性外,更重要的是要抵御胃腸道消化液的傷害,最終順利到達(dá)腸道定植[6,38]。本實(shí)驗(yàn)探究了冰淇淋貯藏過程中嗜酸乳桿菌CICC 6075的耐胃酸性能變化,由表4可以看出,隨著貯藏時(shí)間的延長,冰淇淋B中CICC 6075的耐胃酸性顯著下降(P<0.05),經(jīng)150 d的低溫貯藏,CICC 6075在胃液中保存2 h后活菌數(shù)從凝凍前的(7.62±0.08)lg CFU/g降至(4.36±0.03)lg CFU/g,減少了(3.26±0.11)lg CFU/g;而冰淇淋C中CICC 6075僅降低(0.83±0.17)lg CFU/g,這可能與冷凍及貯藏過程中冰淇淋里本身存在的活菌數(shù)下降有關(guān)。

經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時(shí)間的延長,兩種冰淇淋中CICC 6075在胃液中的存活率均有所下降,且冰淇淋B中CICC 6075裸菌在胃液中的存活率下降更快(6.16%±0.04%),顯著低于冰淇淋C中CICC 6075微膠囊在胃液中的存活率(P<0.05)。這可能是因?yàn)槟齼鲞^程中菌體的細(xì)胞膜受到損傷,加速了胃液的滲透,導(dǎo)致活菌數(shù)在胃液中迅速下降[1]。而微膠囊在冷凍過程中為菌體提供較好的保護(hù),避免其細(xì)胞膜受損,此外,微膠囊致密的結(jié)構(gòu)也可以延緩胃液的滲透,減小胃液對(duì)菌體的損害。Afzaal等[39]也有類似發(fā)現(xiàn),在模擬胃腸實(shí)驗(yàn)中,海藻酸鈉微膠囊中嗜酸乳桿菌ATCC-4356的活菌數(shù)僅下降3 lg CFU/g,顯著低于裸菌的減少量(7 lg CFU/g)。

2.5.2 體外粘附性試驗(yàn) Caco-2細(xì)胞是考察益生菌或致病菌在腸道上皮細(xì)胞的粘附性中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞系之一,常常用來檢測乳酸菌菌株的粘附能力[40]。益生菌對(duì)腸道細(xì)胞的粘附性關(guān)系到其功能特性的發(fā)揮,如通過競爭營養(yǎng)成分或分泌抗菌物質(zhì)來調(diào)節(jié)腸道菌群、減少腸道致病菌、防止感染腸道疾病,加強(qiáng)腸粘膜的屏障作用,刺激宿主的免疫系統(tǒng)等[41]。

本研究以體外培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞株為模型,探究在冰淇淋貯藏過程中,嗜酸乳桿菌CICC 6075的粘附性變化,以及微膠囊對(duì)菌體粘附性的影響(表4),為探討冰淇淋產(chǎn)品的功能性提供依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嗜酸乳桿菌CICC 6075對(duì)Caco-2細(xì)胞的有較高粘附性,這與Adriana等[42]的研究一致,干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的有較高粘附性。益生菌的高粘附性可能與其生理生化特性有關(guān),如有些菌細(xì)胞壁上存在黏液結(jié)合菌毛,可促進(jìn)粘附過程[43]。但在貯藏過程中發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時(shí)間的延長,冰淇淋B和冰淇淋C中粘附于Caco-2細(xì)胞的活菌數(shù)均有所降低,這可能與胃酸處理后冰淇淋中本身存在的活菌數(shù)下降有關(guān),因此,本研究進(jìn)一步計(jì)算了CICC 6075的粘附率。經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時(shí)間的延長,兩種冰淇淋中CICC 6075的粘附率均有所下降,且冰淇淋B中CICC 6075的粘附率下降更快(16.76%±0.05%),顯著低于冰淇淋C中CICC 6075的粘附率(P<0.05)。原因可能是在冰淇淋的貯藏期間,菌體本身的粘附性有所降低,相對(duì)而言,微膠囊可以在一定程度上維持菌體的粘附性。Deepika等[44]也報(bào)道稱在酸奶或冰淇淋的貯藏過程中,其中菌的粘附性會(huì)降低,原因是在儲(chǔ)存過程中細(xì)菌的細(xì)胞表面發(fā)生了構(gòu)象變化,而相比于其他因素(如載體食品基質(zhì)中的脂肪和糖含量),儲(chǔ)存時(shí)間在維持細(xì)菌粘附性方面影響更大。因此,冰淇淋C中CICC 6075的粘附率更高,原因可能是在冷凍及貯藏過程中,微膠囊對(duì)菌體形成保護(hù),減緩了細(xì)菌表面構(gòu)象的變化;也可能是微膠囊壁材對(duì)菌體的粘附性有促進(jìn)作用,具體機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

嗜酸乳桿菌CICC 6075裸菌及微膠囊的添加對(duì)冰淇淋的理化和感官性質(zhì)均無顯著影響。但在冰淇淋的制作過程中,微膠囊由于結(jié)構(gòu)致密可對(duì)菌體提供良好的保護(hù),因而能夠明顯提高CICC 6075的凍后存活率、耐貯藏性(-15 ℃,180 d)、耐胃酸性及對(duì)小腸上皮細(xì)胞的粘附性。基于上述結(jié)果,微膠囊技術(shù)可以明顯提升益生菌對(duì)不良環(huán)境(如低溫、胃液)的抗性,因而可以在保證冰淇淋良好品質(zhì)特性的同時(shí),提高益生菌冰淇淋的功能潛力,具有一定的應(yīng)用前景。