瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定小麥中長穗偃麥草的基因

單張凡

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，江西南昌 330045）

長穗偃麥草是小麥遠(yuǎn)緣雜交利用最廣泛和成功的小麥近緣物種之一，在小麥育種和生產(chǎn)中作出重大貢獻(xiàn)［1］二倍體長穗偃麥草具有抗炎、抗旱等優(yōu)秀性狀，因而人們較早地開展了小麥與長穗偃麥草的遠(yuǎn)緣雜交和回交轉(zhuǎn)育工作，相繼育成了一套完整的小麥-長穗偃麥草二體附加系和代換系［2］，本試驗(yàn)通過DNA提取、PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳法等方法，對(duì)長穗偃麥草雜交的幾個(gè)組合小麥進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)其抗白粉病基因，并驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，以期后續(xù)相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所采用的實(shí)驗(yàn)材料均由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所提供，具體組合為新春37∕XC（長穗偃麥草雜交后代）10、新春37∕XC31、新春37∕XC35

1.2 試驗(yàn)步驟

1.2.1 播種 組合新春37∕XC10取63粒種子、新春37∕XC31取15粒、新春37∕XC35取22粒播種，取5×10的培養(yǎng)盤2盒，在培養(yǎng)盤中放入由農(nóng)場土、肥料土和較為松軟的營養(yǎng)土混合而成的土，撥平土面，將種子從格子中間壓入土中。然后將其轉(zhuǎn)移至溫室，定期澆水。

1.2.2 DNA檢測(cè)溶液的配制 取樣：在小麥1葉1心期進(jìn)行取樣。取2g左右小麥的葉片，放入2mL的離心管中，將離心管放入液氮罐中防止葉片失活。

磨樣：將裝有小麥樣品的離心管從液氮罐中撈出來并迅速放入磨樣機(jī)粉碎。

DNA提?。簩⒁呀?jīng)研磨至粉末狀的樣品撈出，加入0.8mL裂解液（1%SLS裂解液），劇烈振蕩，充分混勻，于室溫 靜 置10min；加 入0.8mL 的CTAB 提 取 液，室 溫 靜 置10min，12000rpm離心10min后，將上清液移至1.5mL離心管中，重復(fù)此操作1次；加入上清液0.6倍體積的預(yù)冷異丙醇，充分混勻，-20℃沉淀30min；4℃10000rpm離心10min，棄上清，加入1mL75%乙醇洗滌沉淀2 遍，每次4℃10000rpm離心5min后棄上清，第3遍用無水乙醇洗滌，離心后棄上清，在超凈工作臺(tái)吹干；向干燥的DNA中加入TE緩沖液，溶解DNA.得DNA提取液

DNA提取液濃度檢測(cè)：使用NanoDrop1000微量紫外-分光光度計(jì)測(cè)定樣品液的純度及質(zhì)量濃度。打開Nano?Drop軟件，設(shè)計(jì)Type為DNA，加入1μL DNA提取液進(jìn)行測(cè)定，得出DNA濃度、260∕280、260∕230數(shù)值。DNA濃度范圍應(yīng)為100ng∕ul左右，若過大，則應(yīng)加入TE緩沖液進(jìn)行稀釋；260∕280數(shù)值應(yīng)在1.9左右；260∕230數(shù)值不得小于2.0。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR體系的構(gòu)建：在離心管中分別加入154.8μL Mix、3.6μL ThpF、3.6μL ThpR，混合離心，在96孔板中先加入1.5μL 檢測(cè)后的DNA，取13.5ul離心后的溶液，封口，放入PCR儀中。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2min；94℃變性20s；根據(jù)不同的引物設(shè)置不同的退火溫度，退火15s；60℃延伸30s；最后72℃延伸7min的擴(kuò)增后的溶液。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 凝膠的配制：稱取2.5g瓊脂糖粉置于250mL的錐形瓶中，加入100mL TAE溶液，將錐形瓶置于微波爐中中火加熱，搖晃后再次置于微波爐中加熱進(jìn)行消泡后，加入5μ LEB染液混合均勻，倒入實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)備好的膠盒中，并放好梳子，靜置10min后小心地垂直拔出梳子。

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：取出已成的膠體，放于電泳槽中，將經(jīng)PCR擴(kuò)增后的DNA溶液小心加入點(diǎn)樣孔，蓋上蓋子，然后啟動(dòng)電泳儀，在140V的電壓下等待20min后取出膠體，放在凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種組合的檢測(cè)結(jié)果利用引物Thp51、Thp43、Thp7、Thp34分別構(gòu)建不同的PCR體系，并利用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)新春37∕XC10、新春37∕XC31、新春37∕XC35進(jìn)行檢測(cè)。不同引物和退火溫度對(duì)3種組合的檢測(cè)結(jié)果見圖1～4。由圖1～4可見：不管是哪一種PCR體系，這幾個(gè)組合的擴(kuò)增結(jié)果并沒有發(fā)生改變，均只有新春37∕XC31、新春37∕XC35的部分幼苗跑出了與長穗偃麥草相同的亮帶，說明這些擁有與長穗偃麥草相同亮帶的品種中導(dǎo)入了長穗偃麥草的基因，且此方法準(zhǔn)確度較高。

2.2 方法重現(xiàn)性的驗(yàn)證采用引物Thp51，退火溫度58.4對(duì)新春37∕XC31和新春37∕XC35的幼苗進(jìn)行重復(fù)3次進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果見圖5～7。

由圖5結(jié)果可見：采用相同的引物相同的退火溫度，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)3次的檢測(cè)，能跑出亮帶的品種類型一致，該方法的重現(xiàn)性較高。

3 結(jié)論與討論

長穗偃麥草是普通小麥的野生近緣種，其基因組DNA序列與小麥具有很高的同源性［3］，本試驗(yàn)結(jié)果表明，應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳法可以檢測(cè)3個(gè)組合中導(dǎo)入的長穗偃麥草基因。瓊脂糖凝膠電泳法所取的樣品為小麥的葉片，取樣后并不影響小麥的正常生長，且可以重復(fù)取樣。該方法不僅重現(xiàn)性好，而且測(cè)得的結(jié)果較為穩(wěn)定，準(zhǔn)確度高，亮帶明顯。由此可見，應(yīng)用這一技術(shù)，可以大規(guī)模篩選已導(dǎo)入某一基因的植株，檢驗(yàn)小麥雜交成功與否。