不同加工方法烏梅UPLC特征圖譜及模式識(shí)別研究

李昕，王瑞，李肖莉，張偉，歐金梅，吳德玲

不同加工方法烏梅UPLC特征圖譜及模式識(shí)別研究

李昕1，2，王瑞1，李肖莉1，張偉1，2，歐金梅1，2，吳德玲1，2

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中藥飲片制造新技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012

研究不同加工方法（烘干、熏制）烏梅的超高效液相色譜特征圖譜，為烏梅質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。采用ZORBA×SB-Aq C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脫，流速0.2 mL/min，檢測波長225 nm，柱溫30 ℃。采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜對共有色譜峰進(jìn)行歸屬；結(jié)合聚類分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA）進(jìn)行分類鑒別，尋找差異化合物。建立了不同加工方法烏梅的特征圖譜，烘干、熏制烏梅分別得到23、40個(gè)共有峰。聚類分析和PCA均能對不同加工方法烏梅進(jìn)行分類，OPLS-DA篩選出枸櫞酸、阿魏酸、咖啡酸、苦杏仁苷4個(gè)質(zhì)量差異控制成分。本研究建立的方法可用于烏梅質(zhì)量控制及其加工炮制規(guī)范研究，并為綜合評價(jià)烏梅質(zhì)量提供可靠依據(jù)。

烏梅；加工方法；特征圖譜；模式識(shí)別

烏梅為薔薇科植物梅Sieb. et Zucc.的干燥近成熟果實(shí)加工而成，具有斂肺止咳、澀腸止瀉、安蛔止痛、生津止渴功效[1]。烏梅主產(chǎn)于我國四川、福建等地，果實(shí)采收后，多通過熏制加工成烏梅。由于熏制時(shí)間較長且耗費(fèi)人力，部分產(chǎn)區(qū)采用烘箱低溫烘干方式加工，市場稱為“生烏梅”。已有研究發(fā)現(xiàn)，青梅經(jīng)熏制加工成烏梅后，其色澤和活性成分與青梅均存在一定差異[2-3]。因此，烏梅的質(zhì)量評價(jià)需考慮不同加工方法的影響。

烏梅富含有機(jī)酸及黃酮類、氨基酸、生物堿等多種化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒、降血脂等藥理作用[4-6]。2015年版《中華人民共和國藥典》以枸櫞酸作為烏梅質(zhì)量控制成分[1]，而單一指標(biāo)成分分析不能從整體上反映其內(nèi)在品質(zhì)。中藥特征圖譜作為一種綜合性、可量化的色譜鑒定方法，能較全面地體現(xiàn)中藥成分的復(fù)雜性和相關(guān)性，已用于烏梅的成分分析[7-10]。本試驗(yàn)針對烘干和熏制2種烏梅加工方法，采用超高效液相色譜法（UPLC）建立特征圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），尋找其主要差異性成分，旨在更全面評價(jià)烏梅藥材的品質(zhì)，為烏梅的質(zhì)量控制及加工品的質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent Technologies1290 InfinityⅡ（含G7120A二元泵系統(tǒng)、G7167B自動(dòng)進(jìn)樣器、G7114B VWD檢測器），美國安捷倫科技有限公司；BSA224S十萬分之一電子分析天平，德國賽多利斯；F80型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市紅太陽機(jī)電有限公司；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SYZ-C型石英自動(dòng)亞沸高純水蒸餾器，南京桑力電子設(shè)備廠；CT-C-型熱風(fēng)循環(huán)烘箱，南京飛翔干燥制冷設(shè)備廠。

對照品枸櫞酸（批號(hào)CFS201702）、奎尼酸（批號(hào)CFS201702）、蘋果酸（批號(hào)CFS201702）、蘆?。ㄅ?hào)CFS201702），武漢天植生物技術(shù)有限公司；對照品綠原酸（批號(hào)MUST-19030620）、龍膽酸（批號(hào)MUST-18083005），成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98.0%；乙腈、甲醇為色譜純（德國默克公司），甲酸為分析純（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司），雙蒸水。

樣品于2018年4－8月采集，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為薔薇科植物梅Sieb.et Zucc.的近成熟果實(shí)。S1～S20為烘箱低溫烘干，溫度60 ℃，時(shí)間30 h；X1～X10為松木煙熏，溫度80～100 ℃，時(shí)間48 h。樣品信息見表1。

表1 30批烏梅樣品信息

編號(hào)加工 方法產(chǎn)地 編號(hào)加工 方法產(chǎn)地 編號(hào)加工 方法產(chǎn)地 S1烘干貴州荔波 S11烘干湖南郴州 X1熏制貴州荔波 S2烘干四川達(dá)州 S12烘干廣西百色 X2熏制四川達(dá)州 S3烘干四川大邑 S13烘干浙江臨安 X3熏制四川大邑 S4烘干四川綿陽 S14烘干廣東汕尾 X4熏制四川綿陽 S5烘干福建上杭 S15烘干廣東汕尾 X5熏制福建上杭 S6烘干福建上杭 S16烘干安徽寧國 X6熏制福建上杭 S7烘干福建上杭 S17烘干安徽黃山 X7熏制福建上杭 S8烘干四川寶興 S18烘干廣西南寧 X8熏制四川寶興 S9烘干四川寶興 S19烘干江蘇蘇州 X9熏制四川寶興 S10烘干云南麗江 S20烘干江蘇溧水 X10熏制云南麗江

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBA×SB-Aq C18色譜柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～6 min，3%～15%B；6～30 min，15%～40%B；30～42 min，40%～55%B；42～47 min，55%～95%B），流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量3 μL，檢測波長225 nm，柱溫30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

Waters Vevo G2-XS Q-TOF MS質(zhì)譜系統(tǒng)采用電噴霧離子源，負(fù)離子掃描模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度120 ℃，掃描范圍m/z 50～1200，掃描時(shí)間0.5 s。低能量掃描時(shí)碰撞能量為6 eV，高能量掃描時(shí)碰撞能量為10～30 eV。

2.3 溶液制備

2.3.1 供試品溶液

取凈制后的樣品適量，去核，干燥粉碎，過2號(hào)篩，取約2.0 g，置于具塞錐形瓶中，加入80%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率300 W，頻率40 kHz）處理30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻并過濾，濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2 混合對照品溶液

分別精密稱取枸櫞酸、蘋果酸、奎尼酸、龍膽酸、綠原酸、蘆丁對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加入80%甲醇溶解并定容至刻度，配制成濃度分別為1.003、0.202、0.113、0.116、0.118、0.123 mL/min的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取S2樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以綠原酸作為參照峰，計(jì)算各主要共有色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時(shí)間RSD為0.031%～0.052%，相對峰面積RSD為0.83%～0.91%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S2樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、10、24 h進(jìn)樣測定，以綠原酸作為參照峰，計(jì)算各主要共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時(shí)間RSD為0.077%～0.390%，相對峰面積RSD為1.97%～2.64%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取S2樣品，按“2.3.1”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以綠原酸為參照峰計(jì)算各主要共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果相對保留時(shí)間RSD為0.022%～0.058%，相對峰面積RSD為3.33%～3.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 特征圖譜建立及相似度評價(jià)

將30批烏梅樣品按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，將色譜圖導(dǎo)入國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》（2012版），得到共有模式。標(biāo)定烘干烏梅23個(gè)共有峰，熏制烏梅40個(gè)共有峰，確定1、3、4、6、8～12、14、17～19、21～25、35、38共20個(gè)特征峰作為烏梅質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)（見圖1）。經(jīng)與對照品比對，指認(rèn)出峰1（奎尼酸）、峰4（枸櫞酸）、峰6（蘋果酸）、峰21（龍膽酸）、峰25（綠原酸）、峰35（蘆?。?。

注：A.烘干供試品；B.熏制供試品；C.混合對照品；1.奎尼酸；4.枸櫞酸；6.蘋果酸；21.龍膽酸；25.綠原酸；35.蘆丁

以共有模式為對照特征圖譜，對30批烏梅樣品的特征圖譜進(jìn)行相似度評價(jià)，結(jié)果見表2。除S16外，烘干、熏制烏梅樣品各自相似度≥0.904，表明其所含化學(xué)成分基本一致。烘干與熏制烏梅的相似度為0.469～0.896，表明2種方法加工的烏梅差異較大。

2.6 質(zhì)譜成分指認(rèn)

通過對照品比對及質(zhì)譜離子碎片信息，初步鑒定出26種成分（見表3），14個(gè)共有峰包括峰3（延胡索酸）、峰8（5-羥甲基糠醛）、峰9（2-乙?；秽⒎?0（甲基環(huán)戊烯醇酮）、峰11（香草酸）、峰12（苯甲酸甲酯）、峰22（苦杏仁苷）、峰24（愈創(chuàng)木酚）等。

表2 30批烏梅樣品指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果

編號(hào)相似度 編號(hào)相似度 編號(hào)相似度 S10.956 S110.950 X10.972 S20.995 S120.968 X20.995 S30.929 S130.957 X30.963 S40.970 S140.981 X40.974 S50.982 S150.986 X50.984 S60.979 S160.884 X60.988 S70.978 S170.904 X70.978 S80.912 S180.978 X80.977 S90.958 S190.921 X90.979 S100.951 S200.924 X100.991

表3 烏梅化學(xué)成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

峰號(hào)鑒定成分分子式[M-H]-二級(jí)質(zhì)譜（m/z）參考文獻(xiàn) 或?qū)φ掌?理論值實(shí)際值誤差/ppm 1奎尼酸C7H12O6191.055 6191.055 5-5.23173.008 2，135.043 3，111.007 1對照品 2果糖或葡萄糖C6H12O6179.055 6179.054 1-8.38152.995 4，132.028 5，111.007 1，96.969 7[11] 3延胡索酸C4H4O4115.003 1115.002 8-2.6196.959 6，87.007 4[12] 4枸櫞酸C6H8O7191.019 2191.018 7-2.62173.008 2，129.019 8，111.009 2對照品 5琥珀酸C4H6O4117.018 8117.019 55.9896.959 6，87.009 3，78.957 1[12] 6蘋果酸C4H6O5133.013 7133.013 1-4.51115.002 8，96.959 6，78.960 8對照品 85-羥甲基糠醛C6H6O3125.023 9125.023 2-5.60111.009 2，96.959 6，78.958 9[13] 92-乙?；秽獵6H6O2109.029 0109.028 2-7.3478.958 9，67.015 0[13] 10甲基環(huán)戊烯醇酮C6H8O2111.044 6111.043 7-8.1095.959 6[13] 11香草酸C6H8O4167.034 4167.034 40152.009 9，123.045 1，111.009 2，96.961 7，78.958 9[14] 12苯甲酸甲酯C8H7O2134.036 8134.037 01.49103.007 1，78.958 9[15] 132,6-二甲氧基苯酚C8H10O3153.055 2153.056 26.53137.021 8，111.007 1，96.959 6[13] 21龍膽酸C7H6O4153.018 8153.018 2-3.92111.007 1，96.959 6，78.967 1對照品 22苦杏仁苷C20H27NO11456.150 6456.148 6-4.38353.086 7，323.099 3[15] 24愈創(chuàng)木酚C7H8O2123.044 6123.042 9-1.3896.959 6，87.009 3[13] 25綠原酸C16H18O9353.087 3353.086 7-1.70317.051 6，299.045 1，191.055 5，179.034 9，135.045 7，111.007 1對照品 26苯甲酸C7H6O2121.029 0121.028 8-1.6577.018 7[15] 30咖啡酸C9H8O4179.034 4179.034 92.79135.045 7，111.009 2，96.959 6[16] 35蘆丁C27H30O16609.145 6609.145 1-8.21301.034 4對照品 36金絲桃苷C21H20O12463.087 7463.088 72.16419.170 4，353.086 7，335.070 2，301.034 4[17] 37異槲皮苷C21H20O12463.108 4463.109 21.73421.187 9，357.120 1，335.077 7，301.034 4，191.018 7，173.008 2[14] 39阿魏酸C10H10O4193.050 1193.049 0-5.70147.030 3，111.009 2[14] 40槲皮苷C21H20O11447.092 7447.095 05.14353.086 7，341.071 2，301.034 4，229.048 4，191.018 7，173.008 2，145.072 9[17] 41牡荊素C21H20O10431.097 8431.097 6-4.64353.086 7，315.087 1，301.069 9，279.233 2，191.018 7，173.008 2[18] 42槲皮素C15H10O7301.034 8301.034 4-1.33279.233 2，273.037 9，229.048 4，191.018 7，173.008 2，151.002 4[17] 43山柰酚C15H10O6285.039 9285.038 3-5.61257.045 5，241.012 2[17]

2.7 聚類分析

將30批烏梅樣品特征圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用組間均聯(lián)法，平方歐氏距離作為樣本測度，對不同加工方法烏梅進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，30批烏梅樣品可分成兩大類（見圖2）。其中，S1～S20烘干烏梅為一類，X1～X10熏制烏梅為一類，與樣品信息一致。

2.8 主成分分析

為觀察不同加工方法烏梅樣品的差異性，采用PCA對30批烏梅樣品進(jìn)行分析。將樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，得到4個(gè)特征主成分。該模型解釋能力參數(shù)R2X為0.818，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.570，表明該模型的區(qū)分程度及預(yù)測程度較好。4個(gè)特征主成分的方差總貢獻(xiàn)率為81.84%。通過PCA得分圖（見圖3）可知，烏梅樣品可分為兩大類，與聚類分析結(jié)果一致。

圖2 30批烏梅樣品聚類分析樹狀圖

2.9 正交偏最小二乘-判別分析

為更好地研究不同加工方法烏梅UPLC特征圖譜的差異，建立OPLS-DA模型。該模型解釋能力參數(shù)R2Y為0.983，預(yù)測能力參數(shù)Q2為0.972，說明模型的區(qū)分程度及預(yù)測程度較好。以主成分建立坐標(biāo)系，由30批樣品的OPLS-DA得分圖（見圖4）可知，烘干烏梅與熏制烏梅可分為兩大類，烘干樣品較為集中，熏制樣品較為分散，表明不同加工方法可導(dǎo)致烏梅化學(xué)成分的量發(fā)生一定程度變化。

圖4 30批烏梅樣品OPLS-DA得分圖

2.10 差異標(biāo)志物篩選

根據(jù)變量重要性投影（VIP）篩選導(dǎo)致不同加工方法樣品差異性的化學(xué)成分，VIP值越大表明其對分類的貢獻(xiàn)最大，當(dāng)VIP＞1時(shí)認(rèn)為其對分類起到關(guān)鍵性作用，但本研究篩選出的成分較多，且部分成分未鑒定出來，故將VIP值提升至1.22，便于分析。最終篩選出對組間分類貢獻(xiàn)較大的4個(gè)變量，依次為峰4（枸櫞酸）、峰39（阿魏酸）、峰30（咖啡酸）、峰22（苦杏仁苷），見圖5。

圖5 烏梅樣品指紋圖譜共有峰差異標(biāo)志物VIP圖

3 討論

本試驗(yàn)建立了30批烘干和熏制烏梅樣品的UPLC特征圖譜，標(biāo)定烘干烏梅23個(gè)共有峰，熏制烏梅40個(gè)共有峰，通過對照品比對和質(zhì)譜分析指認(rèn)了枸櫞酸、蘋果酸、奎尼酸、龍膽酸、綠原酸、蘆丁等14個(gè)共有峰成分。20批烘干樣品（除S16外）、10批熏制樣品各自相似度＞0.90，表明同一加工方法的烏梅樣品相似度良好，質(zhì)量穩(wěn)定。烘干、熏制樣品之間相似度存在一定差異，成分差異較大，表明不同加工方法對烏梅的成分有一定影響。

聚類分析、PCA和OPLS-DA結(jié)果表明，3種方法均能較好區(qū)分烘干烏梅和熏制烏梅。結(jié)合OPLS-DA分析篩選出導(dǎo)致2種加工方法烏梅差異性的化合物，其中對分類影響較大的4個(gè)成分為枸櫞酸、阿魏酸、咖啡酸、苦杏仁苷。枸櫞酸為2015年版《中華人民共和國藥典》烏梅質(zhì)量控制成分，本研究在藥典基礎(chǔ)上增加了3個(gè)質(zhì)量參考成分，有利于從整體反映藥材內(nèi)在質(zhì)量，可為烏梅加工過程中的質(zhì)量控制提供有效參考依據(jù)。不同加工方法造成的烏梅外觀顏色和風(fēng)味差異與其內(nèi)在差異性成分的關(guān)聯(lián)尚有待進(jìn)一步研究。

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Study on UPLC Fingerprints and Pattern Recognition of Mume Fructus with Different Processing Methods

LI Xin1,2, WANG Rui1, LI Xiaoli1, ZHANG Wei1,2, OU Jinmei1,2, WU Deling1,2

To study the UPLC fingerprints of Mume Fructus with different processing methods(drying and smoking); To provide references for quality control of Mume Fructus.ZORBA×SB-Aq C18 column (3.0 mm × 100 mm, 1.8 μm) was used. The mobile phase was 0.1% formic acid water-methanol, gradient elution; the flow rate was 0.2 mL/min; the detection wavelength was set at 225 nm; the column temperature was set at 30 ℃. UPLC-QTOF-MS was used to identify the main common chromatographic peaks. Combining cluster analysis, PCA and OPLS-DA were used for classification and identification, looking for different compounds.The fingerprints of Mume Fructus with drying and smoking were established, and 23 and 40 common peaks were obtained respectively. Cluster analysis and PCA can better classify Mume Fructus with different processing methods, and OPLS-DA can screen out four quality difference control components: citric acid, ferulic acid, caffeic acid and amygdalin.This method can be used to study the quality control and processing standard of Mume Fructus, and provide a reliable basis for the comprehensive quality evaluation of Mume Fructus.

Mume Fructus; processing methods; fingerprints; pattern recognition

R284.1

A

1005-5304(2020)11-0076-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202003723

中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302-1604-01）；新安醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放項(xiàng)目（2018xayx09）；安徽高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJ2019A0479）

歐金梅，E-mail：ojm@ahtcm.edu.cn

（2020-03-27）

（2020-04-15；編輯：陳靜）