智能識別鑒定M蛋白分型

王仁浩，謝 婧，管仲斌，謝松業(yè)△

(1.上海蘭衛(wèi)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所股份有限公司醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，上海 200335；2.澳大利亞阿德萊德大學(xué)，澳大利亞南澳大利亞州阿德萊德 5005)

M蛋白分型種類多,診斷方法除流式細(xì)胞外[1-2]，血清蛋白電泳及免疫學(xué)方法已成為確診M蛋白血癥的重要手段[3-4],其中血清免疫固定電泳對多發(fā)性骨髓癌(MM)患者血清中的單克隆免疫球蛋白(Ig)進(jìn)行分型鑒定具有高特異性和高靈敏性[5]。雖然免疫固定電泳圖譜簡單,但在目前臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中對M蛋白的分型、判斷、識別均是通過人工肉眼觀察，易產(chǎn)生主觀判斷誤差及漏判。本文釆用計(jì)算機(jī)智能鑒定免疫固定電泳M蛋白成分主要的思考方法是先找到M蛋白帶，再根據(jù)其他5個不同組分的圖像信息進(jìn)行綜合匹配處理。根據(jù)健康人的免疫固定電泳6組的一維數(shù)據(jù)的峰高與峰寬的閾值范圍來判斷患者血清免疫固定電泳某組分峰值特征是否有意義，即患有M蛋白血癥。最后，鑒別出不同類型的M蛋白，并給出結(jié)果。這樣大大提高了M蛋白血癥的篩查效率，減少了人為誤差,為臨床診治和預(yù)后提供了科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 標(biāo)本采集：15例免疫固定電泳(書)示范圖片[6]，35例M蛋白血癥標(biāo)本中包括20例不同類型M蛋白血癥患者和15例健康人。標(biāo)本由上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2儀器與試劑 (1)試劑：美國Helena公司提供，試劑批號：3415和3416和3417；(2)儀器設(shè)備：全自動快速電泳分析儀由美國Helena公司提供，為SPIFE 3000型或SPIFE4000型；(3)參數(shù)設(shè)置和操作步驟：詳見REP電泳儀操作規(guī)程；(4)掃描儀：Canon KEW36823。

1.3方法

1.3.1免疫固定電泳測定 方法學(xué)原理：免疫固定電泳將血清或其他標(biāo)本在瓊脂(醋酸纖維素)平板上做區(qū)帶電泳，然后在其上加入已知相應(yīng)單價抗血清，當(dāng)抗體與其區(qū)帶中的單克隆Ig結(jié)合后，便形成抗原抗體復(fù)合物沉淀(固定)下來。通過漂洗和染色，呈現(xiàn)濃而狹窄的著色區(qū)帶，即可判斷單克隆Ig的輕鏈和重鏈類型。一般免疫固定電泳鑒定M蛋白成分主要由6個組分組成:(1)蛋白電泳;(2)IgG;(3)IgA;(4)IgM;(5)免疫球蛋白κ鏈;(6)免疫球蛋白λ鏈。第1組分為總的血清蛋白成分，第2～4組分為“重鏈”(其實(shí)免疫球蛋白是由2條重鏈和2條輕鏈組成)，第5～6組分為輕鏈，共由6個組分的電泳帶組成。健康人免疫固定電泳中的蛋白電泳只出現(xiàn)清蛋白等5種蛋白成分，不出現(xiàn)M蛋白成分區(qū)帶,且IgG、IgA、IgM及κ鏈和λ鏈電泳帶顏色較淺，掃描后一般峰寬大于峰高。采用不同的顏色把3幅峰形電泳圖合并為一張電泳圖，便于直觀顯示給醫(yī)生，為診斷疾病提供合理的依據(jù)。

1.3.2設(shè)計(jì)思路 首先，把6幅圖像經(jīng)過掃描轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)信息。其次，將二維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成一維數(shù)據(jù)，為了便于智能化鑒定M蛋白成分，采用不同的顏色把6幅電泳圖數(shù)據(jù)信息繪制成一張電泳圖，先在其中血清蛋白電泳中找到M蛋白帶，再根據(jù)其他5個不同組分的圖像信息進(jìn)行綜合匹配處理。為了便于參數(shù)傳遞，根據(jù)健康人的免疫固定電泳6組的一維數(shù)據(jù)的峰高與峰寬閾值范圍來判斷患者血清免疫固定電泳某組分峰值特征是否有意義，即是否患有M蛋白血癥。最后鑒別出不同類型的M蛋白，并給出結(jié)果。免疫固定電泳智能化鑒定M蛋白成分的電泳流程見圖1。智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分電泳特點(diǎn)，(1)正常：若蛋白電泳沒有找到M蛋白帶,而且重鏈和輕鏈峰值特征全部無意義輸出正常；(2)正常？建議復(fù)做:僅僅蛋白電泳峰值有意義其余峰值無意義輸出“正常？建議復(fù)做”;(3)游離κ、λ型輕鏈病:若蛋白電泳出現(xiàn)M蛋白,重鏈峰值特征無意義且κ和λ型輕鏈同時有特征性意義時輸出游離κ、λ型輕鏈病;(4)游離κ型合并κ型IgA單克隆免疫球蛋白病:當(dāng)κ或λ有2個有意義峰值a和b時，若IgA有一個有意義的峰值c，a與c橫坐標(biāo)相同，b與c坐標(biāo)不同，則輸出游離κ型合并κ型IgA單克隆免疫球蛋白病;(5)游離κ型輕鏈病:若κ或λ有特征意義峰值，并且重鏈峰值全部無特征意義，則輸出“游離κ型輕鏈病”;(6)κ型IgA單克隆免疫球蛋白病:若蛋白電泳出現(xiàn)M蛋白帶,κ或λ峰值有價值，同時存在有價值的IgA或IgM或IgG，并且前一組峰值橫坐標(biāo)與后一組峰值橫坐標(biāo)相符，則輸出κ型IgA單克隆免疫球蛋白病;(7)κ型IgA單克隆免疫球蛋白病(？):若蛋白電泳出現(xiàn)M蛋白帶,κ或λ有價值峰值，同時存在有價值的IgA或IgM或IgG,但前一組峰值橫坐標(biāo)與后一組峰值橫坐標(biāo)不相符，則輸出κ型IgA單克隆免疫球蛋白病(？);(8)多克隆病:κ或λ有價值，同時IgA或IgM或IgG為有價值寬峰(波高>100同時波寬>波高)，其中峰值“有意義”指峰高大于峰寬4∶1。重鏈指IgG、IgA、IgM，輕鏈指κ型、λ型。

1.3.3實(shí)驗(yàn)過程 (1)利用按鍵精靈電腦軟件把50幅免疫固定電泳圖片按圖中不同深淺的藍(lán)色條帶轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)信息，再將二維數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為一維數(shù)據(jù)。根據(jù)M蛋白與蛋白電泳對應(yīng)的位置、區(qū)帶深淺、寬窄的不同即峰值數(shù)據(jù)的位置和大小及左右峰谷的長度，確立峰高度與峰寬度的比例范圍,血清M蛋白在蛋白電泳中可在α2至γ區(qū)形成濃度高的區(qū)帶,掃描圖中可見基底較窄,高而尖銳的峰,在γ區(qū)蛋白峰高大于峰寬，在β區(qū)和α2區(qū)也是如此,以此參數(shù)來判斷M蛋白的真?zhèn)?大大減少了肉眼判斷的誤差，見圖2。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。智能和傳統(tǒng)兩種方法鑒定M蛋白成分的差異采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 智能化鑒定M蛋白帶流程圖

注：基線與IgM重合。

2 結(jié) 果

2.1把圖片生成的數(shù)據(jù)用自編軟件的程序轉(zhuǎn)化為直觀的一個峰值圖譜，儲存在Excel文檔中。

2.2按免疫固定電泳的區(qū)帶位置染色的深淺和峰高與峰寬的比例關(guān)系，采用計(jì)算機(jī)語言編程，智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分，最后鑒別出不同類型的M蛋白，并做出結(jié)果。

2.2.1采用免疫固定電泳法用SPIFE3000或4000型全自動電泳儀獲得血清標(biāo)本的6張凝膠電泳圖。

2.2.2掃描6張電泳圖片，輸入計(jì)算機(jī)。

2.2.3用按鍵精靈軟件，將6張電泳圖片掃描轉(zhuǎn)換成一維數(shù)據(jù)儲存在Excel文檔里。

2.2.4用自編軟件打開步驟C獲得的Excel文檔數(shù)據(jù)，軟件可以從中獲得免疫固定電泳中蛋白電泳(DY)、IgG、IgA、IgM、κ型、λ型數(shù)據(jù)。獲得各條線的參數(shù)，包括：峰值坐標(biāo)、左波谷坐標(biāo)、右波谷坐標(biāo)、波寬是否大于波高峰值、各線峰值；然后根據(jù)患者蛋白電泳中ɑ至λ區(qū)域的峰值與標(biāo)準(zhǔn)峰值(健康人)同區(qū)域的數(shù)據(jù)比較大小。如果患者輸出的峰值比標(biāo)準(zhǔn)峰值大,則這條線的峰還要進(jìn)一步判斷是否有價值,也就是根據(jù)左波谷坐標(biāo)至右波谷坐標(biāo)的峰寬是否大于峰高,如果峰高大于峰寬,判斷為有價值(含M蛋白帶),然后進(jìn)一步按流程鑒定為哪一類型的M蛋白。

2.2.5輸出鑒別結(jié)果 根據(jù)判斷M蛋白帶的理論依據(jù)尋找屬于哪一類單克隆免疫球蛋白病,并打印報(bào)告，包括κ和λ鏈的比值。κ和λ鏈的比值在采用傳統(tǒng)免疫固定電泳方法肉眼判斷時是無法辨別的,因?yàn)槿庋鄄荒芘袛囝伾纳顪\確切值,而軟件采取的是按鍵精靈的捕色軟件,它可以測出κ和λ鏈的顏色深淺具體值,然而κ和λ鏈的比值在診斷多發(fā)性骨髓瘤是很有價值的。這個結(jié)果和免疫散射比濁法測定κ和λ鏈的比值具有良好相關(guān)性(n=38，r=0.889),經(jīng)統(tǒng)計(jì)κ和λ鏈比值,健康人參考值為1.16±0.2(n=32)，所有M蛋白血癥患者中κ型患者κ和λ的比值明顯大于1.36，而λ型患者κ和λ的比值明顯小于0.96,這個軟件可以同時測定κ和λ鏈，減少了患者再次測定κ和λ鏈所帶來的麻煩。

本文提供一種利用鑒定免疫固定電泳M蛋白成分的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括以下設(shè)備：A步驟的設(shè)備為SPIFE3000或4000型全自動電泳儀，獲得血清標(biāo)本的6張凝膠電泳圖;B步驟的設(shè)備為掃描儀：Canon KEW36823,掃描6張電泳圖片，輸入計(jì)算機(jī);C步驟的設(shè)備為計(jì)算機(jī)用按鍵精靈軟件，將6張電泳圖片掃描轉(zhuǎn)換成一維數(shù)據(jù)儲存在Excel文檔中;D步驟的設(shè)備為自編軟件安裝計(jì)算機(jī)，它可以直接打開步驟C獲得的Excel文檔數(shù)據(jù),然后進(jìn)一步按流程鑒定為哪一種類型的M蛋白并輸出鑒別結(jié)果及圖像。見圖3～5。

圖3 κ型IgM單克隆免疫球蛋白病

2.3實(shí)驗(yàn)的臨床應(yīng)用 由作者和臨床免疫專家[6]選出50幅免疫固定電泳圖像包含血清蛋白電泳圖像。選擇原則是既滿足于常規(guī)檢查的M蛋白類型，又包括很少見的類型和書圖譜上的特例圖像，經(jīng)掃描成圖片后，用按鍵精靈電腦軟件把圖片轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)。采用計(jì)算機(jī)編程智能化鑒定免疫固定電泳M蛋白成分，通過對50幅免疫固定電泳圖像和血清蛋白電泳圖像的數(shù)據(jù)分析，評價自動掃描、鑒定的整體性能。

圖4 游離λ型單克隆免疫球蛋白病

圖5 κ、λ型IgG單克隆免疫球蛋白病

2.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析 采用聯(lián)想電腦M7150，CPU256M內(nèi)存，完成資料標(biāo)本50幅掃描、分析及鑒定，M蛋白區(qū)帶35，正確識別33(94.3%)，其中M蛋白IgG區(qū)帶κ型10,正確識別10(100%),λ型5,正確識別5(100%),κ、λ混合型2,正確識別2(100%)；M蛋白IgA區(qū)帶κ型3,正確識別3(100%),λ型+游離λ型1,正確識別1(100%)；M蛋白IgM區(qū)帶κ型3,正確識別3(100%),λ型1,正確識別1(100%),κ、λ混合型1,正確識別1(100%),混合型λ型IgM + κ型IgG 1,正確識別1(100%),游離κ區(qū)帶1,正確識別1(100%),游離λ區(qū)帶7,正確識別7(100%)。正常人區(qū)帶15,正確識別15(100%)。

2.3.2性能驗(yàn)證 智能和傳統(tǒng)兩種方法鑒定M蛋白成分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。智能化鑒定M蛋白成分方法的正確度為96.0%，靈敏度為94.3%，特異度為100.0%，假陰性率(漏診率)為4.0%，假陽性率(誤診率)為0.0%,陰性似然比為6，Kappa值為0.908，陽性預(yù)測值為100.0%，陰性預(yù)測值為88.0%。

3 討 論

M蛋白血癥是一種漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，浸潤骨髓和軟組織產(chǎn)生M球蛋白及多肽，引起骨骼破壞、腎臟病變和貧血,但該病起病緩慢，無癥狀期長短不定,短至幾個月長達(dá)十余年，由于癥狀多樣化及個體差異，出現(xiàn)的臨床表現(xiàn)繁多和復(fù)雜，初發(fā)病常常不被發(fā)現(xiàn)而多被誤診。亞州人MM發(fā)病率為0.5/100 000～1.0/100 000[7]，70歲以上的老年人發(fā)生率為3%，通過骨髓涂片、組織活檢、X線片來診斷外,其他血清蛋白電泳及免疫學(xué)方法已成為確診MM的重要手段，其中血清免疫固定電泳是對MM患者血清中的單克隆免疫球蛋白進(jìn)行分型鑒定，具有高特異度和高靈敏度，也可以識別M蛋白雙克隆[8]。目前缺乏標(biāo)準(zhǔn)化鑒別分型方法,臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中對M蛋白的分型、判斷、識別都是人工肉眼觀察，易產(chǎn)生主觀判斷誤差及漏判。應(yīng)用計(jì)算機(jī)模式識別技術(shù),能做到與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專家一樣，智能快速、準(zhǔn)確地識別細(xì)胞[9]和DNA凝膠電泳分子量測量[10]，但未見智能鑒定M蛋白的成分。本系統(tǒng)應(yīng)用電腦掃描模式識別技術(shù)，采用可對血清蛋白電泳和免疫固定電泳圖譜實(shí)現(xiàn)自動識別、分類、綜合分析給出正確鑒別結(jié)果,該方法可以同時計(jì)算出κ和λ鏈,因?yàn)槿庋鄄荒芘袛囝伾拇_切深淺值，然而κ和λ鏈的比值診斷MM是很有價值的[11-12]。這個軟件可以同時測定κ和λ鏈比值,減少了患者再次測定κ和λ鏈所帶來的麻煩。通過對50幅免疫固定電泳圖像的數(shù)據(jù)分析，雖然合并游離輕鏈判斷有漏檢,但評價自動掃描整體性能的鑒定及臨床應(yīng)用準(zhǔn)確度達(dá)96%,Kappa值達(dá)0.908，與傳統(tǒng)方法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 結(jié) 論

計(jì)算機(jī)能做到與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專家一樣，智能快速、準(zhǔn)確地識別M蛋白的成分，并鑒定出是哪一種類型的M蛋白病,提高了檢查效率，減少了人為誤差，給臨床實(shí)驗(yàn)室?guī)砹藰O大的方便，也為臨床醫(yī)生鑒別診治和預(yù)后提供了科學(xué)依據(jù)。