肺泡灌洗液和痰液涂片抗酸染色半定量與GeneXpert MTB/RIF半定量分析臨床應(yīng)用*

劉桂治，周 旋,林茂銳，李明友,孫 亮，余子龍，曹東林

(廣東省第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部,廣東廣州 510317)

一直以來，結(jié)核病都是受全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)我國結(jié)核病患者登記情況,廣東省是結(jié)核疫情最為嚴(yán)重的幾個區(qū)域之一[1-3]。GeneXpert MTB/RIF是近年來實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)核病的新興技術(shù)，因其方便、快捷、靈敏度高，已在臨床廣泛應(yīng)用[4-5]。隨著2017年頒布的新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)中加入支氣管鏡檢查及氣管、支氣管結(jié)核鏡下表現(xiàn)，肺泡灌洗液逐漸成為GeneXpert MTB/RIF檢測的主要標(biāo)本[2]，結(jié)核桿菌載量的半定量對結(jié)核病患者的追蹤治療觀察有重要價值。本研究擬回顧性調(diào)查分析GeneXpert MTB/RIF技術(shù)和結(jié)核涂片抗酸染色半定量在臨床中的應(yīng)用，探討不同類型的標(biāo)本應(yīng)用于該項(xiàng)診斷新技術(shù)對結(jié)核病診治的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性調(diào)查分析本院2017年6月至2019年6月送檢的肺泡灌洗液患者820例，其中男499例，女321例，年齡15～89歲?；仡櫺哉{(diào)查分析本院同期疑似結(jié)核病患者249例，比較GeneXpert MTB/RIF半定量檢測與涂片抗酸染色半定量檢測結(jié)果。

1.2研究方法

1.2.1肺泡灌洗液與痰液標(biāo)本準(zhǔn)備[1]肺泡灌洗液收集：按照病變部位選擇灌洗肺段，將電子支氣管鏡頂端插入肺段支氣管開口處，經(jīng)活檢孔注入2%利多卡因2 mL行肺段局部麻醉，然后注入37 ℃生理鹽水5～10 mL，重復(fù)灌洗肺部2～3次，收集肺泡灌洗液約15 mL，3 000 r/min離心15 min備用。痰液標(biāo)本：患者晨起立即用清水漱口后，咳出深部的第2口、第3口痰液。收到痰液后進(jìn)行痰液常規(guī)判斷是否為合格痰液，若不合格囑其重新留取。

1.2.2涂片抗酸染色 取0.05～0.10 mL患者痰液標(biāo)本或肺泡灌洗液沉渣標(biāo)本在玻片上涂抹成卵圓形的膜，面積為1 cm×2 cm，萋-尼氏染色法抗酸染色，鏡檢，涂片檢查按《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》[1]操作。按照萋-尼氏染色鏡檢結(jié)果分級報告，抗酸桿菌陰性(-)：連續(xù)觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌，報告抗酸桿菌菌數(shù)1～8條/300視野；抗酸桿菌陽性(+)：3～9條/100 視野；抗酸桿菌陽性(++)：1～9條/10視野；抗酸桿菌陽性(+++)：1～9條/每個視野；抗酸桿菌陽性(++++)：≥10條/每個視野?？顾崛旧涸噭┖杏芍楹Ｘ愃魃锛夹g(shù)有限公司提供。

1.2.3GeneXpert MTB/RIF技術(shù) GeneXpert MTB/RIF系統(tǒng)和檢測試劑盒由賽沛(上海)商貿(mào)有限公司提供。GeneXpert MTB/RIF技術(shù)不同標(biāo)本類型按照儀器說明書規(guī)范操作。結(jié)核分枝桿菌檢測基于標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的Ct值，結(jié)果將以高、中、低或非常低來顯示，其中Ct<16為高水平，Ct為16～22為中等水平，Ct>22～28為低水平，Ct>28為極低水平。

2 結(jié) 果

2.1支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的科室分布 在所有送檢標(biāo)本中，呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科送檢率最高，為38.54%,其次是重癥監(jiān)護(hù)室，為24.51%，其余科室送檢率較低，見表1。

表1 支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本的科室分布(n=820)

表2 GeneXpert MTB/RIF技術(shù)與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果比較

2.2GeneXpert MTB/RIF技術(shù)與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果比較 根據(jù)2017年肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)，挑選符合臨床診斷的病例249例，將249例按照標(biāo)本類型分類，GeneXpert MTB/RIF技術(shù)與涂片抗酸染色法檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，痰液(137例)和肺泡灌洗液(104例)占大部分，其他標(biāo)本類型如腦脊液(4例)、大便(2例)和關(guān)節(jié)穿刺液(2例)較少。其中痰液陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為36.6%、95.5%；肺泡灌洗液的陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為43.2%、98.3%。

2.3肺泡灌洗液與痰液在不同涂片半定量時GeneXpert MTB/RIF的Ct值比較 對GeneXpert MTB/RIF陽性標(biāo)本(肺泡灌洗液44例，痰液71例)按照涂片半定量標(biāo)準(zhǔn)分類后比較，當(dāng)涂片半定量結(jié)果為(-)、(+)時，肺泡灌洗液在進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值明顯不同于痰液，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； 當(dāng)涂片半定量結(jié)果為(++)、(+++)、(++++)時，肺泡灌洗液在進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 肺泡灌洗液與痰液在不同涂片半定量時GeneXpert MTB/RIF的Ct值比較

3 討 論

2011-2015年我國共登記結(jié)核病患者發(fā)病4 562 613例，死亡12 598例，其中僅培養(yǎng)陽性患者發(fā)病11 692例，患者的地區(qū)分布最高為廣東省[3]，這可能與廣東人口密度較高，空氣潮濕悶熱，使結(jié)核桿菌很容易傳播有關(guān)。目前，雖然我國結(jié)核病患者的數(shù)量正在逐年減少，但每年仍然有高達(dá)80多萬的發(fā)病數(shù)，表明我國在結(jié)核病的防治道路上依然任重道遠(yuǎn)。已有研究表明，早期診斷和合理的治療對結(jié)核病的控制極為重要[1]。許多結(jié)核病疑似患者并沒有典型的影像學(xué)征象，部分初發(fā)患者也缺乏典型的臨床癥狀，因此，實(shí)驗(yàn)室檢查就顯得尤為重要[6]。GeneXpert MTB/RIF技術(shù)是一項(xiàng)以結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)的全自動分子診斷方法，因其實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求簡單，操作容易，實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求門檻低，所以在世界范圍內(nèi)容易推廣[7-8]。2017年頒布的新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)將結(jié)核分枝桿菌核酸檢測加為確診條件之一[2]。

隨著2017年頒布的新版肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)里加入支氣管鏡檢查及氣管、支氣管結(jié)核鏡下表現(xiàn)[2]，呼吸科及重癥監(jiān)護(hù)室等結(jié)核重點(diǎn)監(jiān)護(hù)科室對支氣管鏡診療日益重視，肺泡灌洗液送檢比例大大提高。本研究回顧性分析結(jié)果顯示，本院2017年6月至2019年6月肺泡灌洗液送檢科室以呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科及重癥監(jiān)護(hù)室最多。其他科室送檢率較低，雖然與患者類型分布有極大聯(lián)系，但其他科室對支氣管肺泡灌洗液的診斷價值認(rèn)識仍存在不足。將符合臨床診斷的標(biāo)本(249例)的GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測結(jié)果與對應(yīng)涂片抗酸染色法結(jié)果進(jìn)行比較，提示痰液和肺泡灌洗液標(biāo)本陰性預(yù)測值較高(95.5%～98.3%)，與其他研究較為接近[9]，而陽性預(yù)測值較低(36.6%～43.2%)，這可能與綜合性醫(yī)院相對于傳染病?？漆t(yī)院，初次就診患者較多有關(guān)。其余標(biāo)本類型由于數(shù)據(jù)有限，其預(yù)測價值有限，其中4例GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測陰性，而涂片抗酸染色法陽性患者為非結(jié)核類分枝桿菌污染導(dǎo)致。表明GeneXpert MTB/RIF技術(shù)能夠大大提高結(jié)核病的陰性預(yù)測值，準(zhǔn)確區(qū)分結(jié)核分枝桿菌與其他抗酸陽性的非結(jié)核分枝桿菌，這在其他研究中也有類似結(jié)論[10-11]。因此，對于結(jié)核患者的診斷，仍需結(jié)合其他影像學(xué)或病原生物學(xué)結(jié)果綜合分析。

結(jié)核桿菌的半定量對結(jié)核病患者的追蹤治療及觀察具有重要價值[1]，但GeneXpert MTB/RIF技術(shù)采用的半定量檢測與傳統(tǒng)的涂片抗酸染色半定量方法是否有一定相關(guān)性尚不清楚。本研究對臨床確診的結(jié)核患者回顧性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測陽性的標(biāo)本中，當(dāng)涂片抗酸染色半定量結(jié)果為(-)、(+)時，GeneXpert MTB/RIF檢測各組Ct值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測Ct值對結(jié)核桿菌半定量有一定的提示作用。肺泡灌洗液應(yīng)用于GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測是否優(yōu)于痰液？本研究調(diào)查表明，當(dāng)涂片抗酸染色半定量結(jié)果為(-)、(+)時，肺泡灌洗液在進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；當(dāng)涂片半定量結(jié)果為(++)、(+++)、(++++)時,肺泡灌洗液在進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF檢測時Ct值與痰液差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明在結(jié)核患者細(xì)菌載量較高的情況下，采集肺泡灌洗液或痰液進(jìn)行GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測對病原學(xué)檢測結(jié)果判定影響不大，當(dāng)細(xì)菌載量涂片抗酸染色半定量為(-)、(+)時，留取肺泡灌洗液有助于提高檢出率，這與邱文娜等[12]的研究有一定區(qū)別，在他們的研究中總體認(rèn)為GeneXpert MTB/RIF技術(shù)檢測肺泡灌洗液靈敏度更高，這可能是因?yàn)樗麄儧]有對細(xì)菌載量半定量區(qū)分的原因。在細(xì)菌水平較低時，進(jìn)行針對性的肺段沖洗能夠增加結(jié)核桿菌的獲取概率，而痰液中經(jīng)常混合口咽部其他雜菌，這些雜菌對結(jié)核桿菌的核酸擴(kuò)增也會產(chǎn)生一定程度的抑制。當(dāng)結(jié)核桿菌細(xì)菌載量較高時，結(jié)核桿菌的核酸水平和純度已經(jīng)足夠高，在不同類型標(biāo)本中擴(kuò)增差異不大。因此，支氣管鏡診療的推廣應(yīng)用是結(jié)核病防治能力提高的一項(xiàng)重要措施[13]。

4 結(jié) 論

結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)已取得極大的進(jìn)展，新的檢測技術(shù)大大提高了結(jié)核病診斷的靈敏度和特異度，但不管是哪種檢測技術(shù)，均存在一定的局限性[14]。在研究新技術(shù)GeneXpert MTB/RIF應(yīng)用深度的同時也要擴(kuò)展其廣度，本研究提示，肺泡灌洗液相對于痰液在結(jié)核桿菌低載量時應(yīng)用GeneXpert MTB/RIF技術(shù)具有更好的提示作用。未來聯(lián)合多種檢測技術(shù)，對疑似結(jié)核病患者同時進(jìn)行診斷，綜合分析檢測結(jié)果，將成為結(jié)核病防治的重要方向。