白細(xì)胞介素-6、微小RNA-210與子癇前期的相關(guān)性及其臨床價值*

段玉萍,鐘麗麗,洪 茂,謝 驪,蔡雷鳴,吳晶晶,陳 雄,厲 倩△

(上海市寶山區(qū)吳淞中心醫(yī)院：1.檢驗(yàn)科；2婦產(chǎn)科，上海 200940)

子癇前期(PE)是一種常見的妊娠期特發(fā)的多系統(tǒng)紊亂綜合征，全球發(fā)病率為2%～8%，是孕產(chǎn)婦發(fā)病率和病死率最高的疾病之一，以妊娠20周后新發(fā)的高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床癥狀[1]。PE病因的異質(zhì)性很強(qiáng)，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，被認(rèn)為是一種胎盤源性疾病，去除胎盤才能根治PE。PE的預(yù)測對于早期預(yù)防、治療及降低母嬰病死率有重要意義，但目前還沒有特別有效、可靠和經(jīng)濟(jì)的預(yù)測方法。缺氧、內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和無菌性系統(tǒng)性炎癥被認(rèn)為在PE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[1-2]。微小RNA-210(miR-210)是低氧誘導(dǎo)的微小RNA，已有報道m(xù)iR-210在PE患者胎盤和血清中表達(dá)水平升高[3-4]。miR-210可通過抑制靶基因的表達(dá)而發(fā)揮調(diào)控作用。炎癥因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)與妊娠及PE的發(fā)病關(guān)系密切，PE患者孕中晚期IL-6水平升高[5]，但PE患者外周血中升高的miR-210與IL-6水平是否存在相關(guān)性尚少見相關(guān)報道。本文采用實(shí)時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)分別檢測PE患者和正常妊娠女性不同孕期血清miR-210、IL-6表達(dá)水平，探討血清miR-210及IL-6在正常妊娠女性及PE患者妊娠過程中的變化規(guī)律，分析miR-210和IL-6的相關(guān)性及臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 經(jīng)過本院倫理委員會批準(zhǔn)，本研究納入2015年1月至2018年12月在本院分娩的PE產(chǎn)婦(PE組)和無明確妊娠相關(guān)疾病產(chǎn)婦(對照組)各82例作為研究對象。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考第9版《婦產(chǎn)科學(xué)》[6]：在妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140 mm Hg和(或)舒張壓≥90 mm Hg，伴尿蛋白≥300 mg/24 h，或隨機(jī)尿蛋白(+)，或雖無蛋白尿但合并有下列任何一項(xiàng)者。血小板減少、肝功能損害、腎功能損害、肺水腫、新發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常或視覺障礙。本研究所有研究對象排除妊娠感染、妊娠期糖尿病，且均為單胎妊娠，對照組和PE組一般資料具有可比性，兩組孕婦年齡、孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和初胎比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對照組孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血液標(biāo)本均為82例，初胎比率為48.8%(40/82)，年齡22～37歲，孕前BMI(21.7±3.3)kg/m2；PE組完成孕早期標(biāo)本收集70例、孕中期標(biāo)本收集80例、孕晚期標(biāo)本收集82例，初胎比率為46.3%(38/82)，年齡22～38歲，孕前BMI(23.1±3.5)kg/m2，PE診斷孕周(35.1±2.8)周。

1.2標(biāo)本采集、處理及保存 采用真空采血管采集研究對象空腹全血標(biāo)本3～5 mL，靜置20 min后用離心力1 500×g首次離心10 min，收集上層血清后用12 000×g離心力二次離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至無RNA酶的無菌容器中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3血清RNA提取 采用試劑盒miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)提取血清中總RNA，操作步驟參見本課題組已經(jīng)發(fā)表的文章[7]，簡述如下：將1 mL的Trizol 溶解液加入200 μL血清中，充分顛倒混勻后室溫靜置2 min后加入3.5 μL的cel miR-39(1.6×108/μL,Qiagen)作為內(nèi)參，然后依次用三氯甲烷、無水乙醇、緩沖液、80%乙醇溶液等，末次洗滌后的洗脫柱高速離心5 min，最后加入14 μL無RNA酶水溶解總RNA。

1.4反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR 采用二步法分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR[7]。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Ⅱ(Qiagen)合成cDNA第1鏈(加尾法)，將總體積為20 μL的反轉(zhuǎn)錄體系置于擴(kuò)增儀(Bioer)中，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min。采用熒光定量PCR試劑盒miScirpt SYBR green PCR(Qiagen)和PCR擴(kuò)增儀ABI 7500進(jìn)行熒光實(shí)時定量PCR。PCR反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中含2 μL 100倍稀釋的cDNA[7]。以RNA抽提過程中加入的cel-miR-39為內(nèi)參基因。cel-miR-39和miR-210分別在兩孔中進(jìn)行擴(kuò)增，每個標(biāo)本每個基因均設(shè)置3個平行復(fù)孔，Ct值取3孔平均值。單個標(biāo)本miR-210的表達(dá)水平用相對miR-39的Ct差值表示，miR-210差異表達(dá)的相對定量分析用2-ΔΔCt法。

1.5血清IL-6水平測定 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(BD)檢測孕婦血清IL-6水平，具體操作步驟參見說明書，該試劑盒的檢出限為2.2 pg/mL，且重復(fù)性、精密度和中間精密度均<10%。

2 結(jié) 果

2.1PE組和對照組孕早、中、晚期血清IL-6表達(dá)水平比較 對照組不同孕期的血清IL-6表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PE組孕晚期IL-6表達(dá)水平明顯高于孕早期和孕中期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PE組孕晚期IL-6表達(dá)水平明顯高于對照組孕晚期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PE組孕中期IL-6表達(dá)水平雖然高于對照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.12)。PE組和對照組孕早期IL-6表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 PE組和對照組孕早、中、晚期血清IL-6表達(dá)水平比較[ M(P25～P75)，pg/mL]

2.2PE組和對照組孕早、中、晚期血清miR-210表達(dá)水平比較 對照組不同孕期的血清miR-210表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PE組孕晚期miR-210表達(dá)水平明顯高于孕早期和孕中期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PE組孕中期和孕晚期miR-210表達(dá)水平均明顯高于對照組孕中期和孕晚期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PE組和對照組孕早期miR-210表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 PE組和對照組孕早、中、晚期miR-210表達(dá)水平比較

2.3孕早、中、晚期血清IL-6和miR-210相對表達(dá)水平相關(guān)性分析 進(jìn)一步對血清IL-6和miR-210的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，血清IL-6和 miR-210的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.57，P<0.01)。見圖1。

圖1 血清IL-6和miR-210表達(dá)量的相關(guān)性分析

3 討 論

本研究通過分析PE患者和正常妊娠女性孕早、中、晚期血清miR-210和IL-6表達(dá)水平變化發(fā)現(xiàn)，在正常妊娠過程中，外周血miR-210、IL-6表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在PE患者妊娠過程中，在孕20周后miR-210表達(dá)水平升高，在妊娠28周后IL-6水平明顯增加，且miR-210與IL-6的表達(dá)呈正相關(guān)。miR-210是低氧誘導(dǎo)的微小RNA，低氧環(huán)境可以通過增加低氧誘導(dǎo)因子1α的表達(dá)使miR-210水平上調(diào)[8]。除了低氧，氧化應(yīng)激壓力和炎癥也能調(diào)節(jié)miR-210的表達(dá)水平。IL-6是gp130家族的細(xì)胞因子，可由多種細(xì)胞分泌，IL-6通過細(xì)胞膜上的gp130向JAK/STAT3通路傳遞信號，參與免疫反應(yīng)、急性時相反應(yīng)。

胎盤灌注不足進(jìn)而引起全身各系統(tǒng)灌注減少，是PE的重要特征。PE是一種動態(tài)性疾病，病情可呈持續(xù)性發(fā)展，主要臨床表現(xiàn)為妊娠20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，部分患者有多臟器和多系統(tǒng)損害，嚴(yán)重者可發(fā)生子癇[9]。胎盤灌注不足引起的胎盤低氧環(huán)境導(dǎo)致大量毒性因子釋放進(jìn)入外周循環(huán)，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、血管收縮、血壓升高，出現(xiàn)多系統(tǒng)功能紊亂，這是PE的基本病理變化。本研究中PE患者孕中、晚期miR-210表達(dá)水平升高的結(jié)果與PE患者全身低灌注的病理變化相符，也與文獻(xiàn)[3-4]報道一致。胎盤中升高的miR-210可能以外泌體的形式分泌到外周血中[10]，進(jìn)而引起外周血中miR-210表達(dá)水平升高。上調(diào)的miR-210可通過抑制HOXA9、EFNA3、THSD7A等靶基因的表達(dá)，減弱滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力[3-4]，但這個過程與PE的病因相關(guān)，發(fā)生在妊娠20周前。miR-210上調(diào)可能是PE的病因，也可能是PE的表現(xiàn)，本研究中PE患者孕中、晚期外周血miR-210水平升高的結(jié)果提示，miR-210水平升高可能是PE的一種反饋性機(jī)制，這種反饋性機(jī)制是保護(hù)性還是危害性尚不得而知。

從免疫學(xué)角度看，妊娠是一個同種異體的移植過程，是一個全身低度無菌炎癥狀態(tài)，表現(xiàn)為妊娠女性的白細(xì)胞增多、補(bǔ)體活化等，難治性高血壓、蛋白尿等PE臨床癥狀是全身失控性炎性反應(yīng)的表現(xiàn)[11]。有文獻(xiàn)報道，PE患者孕中、晚期外周血炎癥因子IL-6水平明顯高于正常妊娠女性，且重度PE患者的循環(huán)IL-6水平高于輕度PE患者，IL-6可以進(jìn)一步誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮素1(ET-1)，ET-1與血管舒縮、水鈉潴留密切相關(guān)，IL-6中和抗體使PE小鼠的高血壓和蛋白尿水平降低[5,12-13]，說明IL-6在PE的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,降低IL-6水平可能控制PE的臨床癥狀，從而延長妊娠時間，使母嬰受益最大化。但也有研究指出，PE患者的外周血IL-6水平與正常妊娠女性無差異[14-15]，這可能與標(biāo)本的采集時間(孕周、是否空腹)及研究對象的組成差異相關(guān)。本研究所有標(biāo)本均為空腹采集，兩組研究對象孕前BMI無明顯差異，排除了感染、糖尿病等其他妊娠并發(fā)癥，PE患者在妊娠28周后血清IL-6水平高于同孕周的對照組，支持PE患者孕后期IL-6水平升高的論點(diǎn)。

本研究通過分析正常妊娠女性及PE患者不同孕期血清miR-210和IL-6的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-210與IL-6呈正相關(guān)，miR-210可能通過某種機(jī)制與炎性反應(yīng)、IL-6分泌關(guān)聯(lián)，這可能對PE的發(fā)病機(jī)制研究有一定意義。本研究通過探索妊娠各期外周血中miR-210、IL-6的水平變化規(guī)律發(fā)現(xiàn)，PE患者孕中、晚期miR-210和IL-6表達(dá)水平上調(diào)，其表達(dá)上調(diào)先于PE的臨床診斷，提示血清miR-210和IL-6可能是PE的預(yù)測和診斷生物標(biāo)志物。但由于本研究的病例數(shù)有限，且未對PE的疾病嚴(yán)重程度進(jìn)行分類，其結(jié)果可能具有一定程度的偏倚，有待更多的研究來證實(shí)。

4 結(jié) 論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期血清miR-210與IL-6的表達(dá)有一定相關(guān)性，PE患者孕中、晚期miR-210和IL-6表達(dá)水平上調(diào)，孕中、晚期血清IL-6和 miR-210可能是PE預(yù)測和診斷的良好標(biāo)志物。