基于主成分分析微波提取圓頭蒿多糖工藝中單糖組分變化

郭淑娟,朱晟永,賈 悅,李 敏,王露露,李 麗,王俊龍,2,趙 瀟,2,*(.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心,甘肅蘭州 730070)

近年來,天然多糖被公認(rèn)為天然免疫調(diào)節(jié)劑,具有抗腫瘤[1]、抗病毒[2]、抗氧化[3]等免疫調(diào)節(jié)功能[4],具有很高的利用價(jià)值,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域[5]。圓頭蒿(ArtemisiasphaerocephalaKrasch)作為一種菊科植物,廣泛分布于我國(guó)西北部和蒙古國(guó)的荒漠地帶[6]。其種籽富含植物油脂和多糖,具有潛在的生物質(zhì)能源價(jià)值[7-8]。因此,從圓頭蒿種籽中高效提取圓頭蒿多糖(ASP),研究提取工藝對(duì)ASP單糖組分的影響,對(duì)于進(jìn)一步充分利用天然生物資源具有一定的意義。

在眾多的多糖提取過程中[9],微波輔助提取法是常用且高效的提取方法[10-15],在電磁場(chǎng)的作用下能夠有效分離多糖中的主要組分,并且具有加熱充分、減少溶劑用量、易于控制等優(yōu)點(diǎn)[16]。然而,微波提取工藝條件對(duì)多糖的單糖組分有著不可忽略的影響,例如微波提取短時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞膜破碎作用較大,可能會(huì)降低了某些反應(yīng)的活化能,或使多糖內(nèi)部自身的化學(xué)鍵斷裂,發(fā)生裂解,生成小的分子片段降低分子質(zhì)量等一系列不定因素[17]。其次,單糖組成及含量的變化將直接影響多糖發(fā)揮生物活性,Ferreiraa等[18]在研究中報(bào)導(dǎo),不同的單糖組成和糖鏈連接方式直接影響了多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。最近研究也表明含有葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的多糖更能有效刺激正常脾淋巴細(xì)胞增殖增強(qiáng)免疫活性[19]。因此有必要對(duì)微波提取工藝中對(duì)單糖組分含量的影響因素進(jìn)行分析研究,為進(jìn)一步探究多糖的構(gòu)效關(guān)系提供基礎(chǔ)。

主成分分析(Principal component analysis,PCA)[20-21]是一種標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)分析方法,被廣泛應(yīng)用于很多科學(xué)領(lǐng)域,如生物統(tǒng)計(jì)學(xué)、神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)和化學(xué)數(shù)據(jù)分析等。該方法通過少數(shù)的結(jié)果因子描述各因素之間的相互關(guān)系以及內(nèi)部框架,并且計(jì)算出的新指標(biāo)要盡可能不相關(guān)并全面的反應(yīng)原始變量的信息,便于在研究復(fù)雜問題時(shí)能夠抓住主要的信息,從而更容易掌握主要原因,更容易清楚的了解事物的內(nèi)部聯(lián)系[22-23]。本文利用SPSS軟件[24]中的主成分分析法對(duì)不同微波提取工藝得到ASP的六種單糖進(jìn)行降維分析,利用提取出的主成分將六種單糖分類,最后通過成分得分矩陣的數(shù)據(jù)比較成分得分系數(shù)分析出不同條件下主要變化的單糖。此外,利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法,不僅能夠有效對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中微波提取三變量的影響權(quán)重進(jìn)行分析,而且對(duì)圓頭蒿多糖中的重要單糖組分進(jìn)行分析得出結(jié)論,為進(jìn)一步的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

圓頭蒿膠 上海鼎芬化學(xué)科技有限公司;95%乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、苯酚(分析純重蒸餾試劑)、三氟乙酸(TFA,4 mol/L)、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐、無水硫酸鈉、氯仿 分析純(≥98%),單糖標(biāo)品(L-鼠李糖、D-來蘇糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-果糖) 色譜純(≥99%),晶純生化科技股份有限公司。

BL320H型電子天平 島津公司;SB-35型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械株式會(huì)社;TSQ-8000氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技公司;集熱式磁力攪拌器 常州申光儀器有限公司;DZF-6020型真空干燥箱 上海愛朗儀器有限公司;DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 河南天帝電子科技有限公司;UV751GD紫外/可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司;MG08S-2B微波實(shí)驗(yàn)儀 南京江研微波系統(tǒng)工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 圓頭蒿多糖提取 稱取一定量的市售圓頭蒿膠粉,按照1∶300 g/mL的料液比與去離子水混合。再按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的微波提取時(shí)間(5、15、30、60、90、120 min)、微波提取功率(100、300、500、700、850 W)和提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)等條件進(jìn)行微波輔助浸提(其中固定因素為60 min、600 W和60 ℃)。提取完畢待冷卻后抽濾棄去殘?jiān)?濾液以4000 r/min離心10 min,將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到原體積的1/5,加入95%的乙醇,終體積為80%,靜置后將多糖沉淀,然后再次4000 r/min離心10 min,棄去上清液,向離心管內(nèi)加入少許蒸餾水,用玻璃棒攪拌使之溶解后倒入培養(yǎng)皿中,再加入95%的乙醇沉淀,冷凍干燥,得到圓頭蒿多糖(ASP)[25]。

1.2.2 GC-MS單糖組成分析方法 前期研究結(jié)果表明[25],ASP由L-阿拉伯糖、D-木糖、D-來蘇糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖六種單糖組成,摩爾比為1∶4.98∶1.69∶27.86∶3.76∶13.92,其中甘露糖和半乳糖為主要單糖組成成分。GC-MS單糖組成分析方法參照實(shí)驗(yàn)室先前研究[25-26]。

1.2.2.1 樣品水解 10 mg的ASP樣品(精密天平稱量)放入20 mL反應(yīng)瓶中,加入5 mL三氟乙酸(TFA,4 mol/L),120 ℃下氮?dú)獗Ｗo(hù)水解8 h,加壓至0.8 MPa蒸干TFA。

1.2.2.2 水解產(chǎn)物的衍生化 水解后的樣品加入10 mg鹽酸羥胺和2 mL吡啶,90 ℃下反應(yīng)30 min,冷卻后加入2 mL乙酸酐,90 ℃下乙?；磻?yīng)30 min,減壓蒸干,加少量氯仿溶解,進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.3 單糖組成的GC-MS分析 氣相色譜條件:柱子:HP-5MS(30 m×0.32 mm×0.20 μm);進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:3 μL;氣體:He;流速:1.0 mL/min。質(zhì)譜條件:掃描范圍:35～600 u;EI離子源;離子源溫度:250 ℃;四級(jí)桿溫度:160 ℃。得到的圖譜使用NIST譜庫進(jìn)行檢索。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)單糖的色譜峰保留值進(jìn)行對(duì)照以確定樣品中單糖的種類,采用色譜峰面積歸一化法測(cè)定樣品中單糖的摩爾比例。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,運(yùn)用SPSS分析中的主成分分析時(shí),需要將所得數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,解決不同量綱之間的單位問題。數(shù)據(jù)經(jīng)過整理后,利用SPSS 19.0進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)操作,將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單糖組成及其含量分析

本研究利用GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)ASP中單糖組分的乙?；a(chǎn)物含量,以此來測(cè)定ASP在不同微波提取條件下樣品單糖組成的變化,來初步探討微波提取對(duì)單糖組成的影響及多糖內(nèi)主要單糖的變化趨勢(shì)。其次,使用主成分分析法基于不同微波提取條件(時(shí)間、功率和溫度),對(duì)ASP中的單糖組分進(jìn)行研究,并通過SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2.1.1 不同微波提取時(shí)間條件下ASP中單糖組分分析 微波提取時(shí)間直接影響著反應(yīng)基質(zhì)中極性分子在磁場(chǎng)內(nèi)快速、定向的排列,以及極性分子之間產(chǎn)生撕裂和相互摩擦的程度[27]。圖1展示了在不同時(shí)間梯度下經(jīng)微波處理的ASP樣品中6種單糖組分含量的變化。

圖1 微波提取時(shí)間對(duì)ASP各單糖組分含量的影響Fig.1 Influence of microwave extraction time on the monosaccharide composition content of ASP注:A:來蘇糖;B:阿拉伯糖;C:木糖;D:甘露糖;E:葡萄糖;F:半乳糖；圖3、圖5同。

由圖1可以看出,改變微波提取時(shí)間,圓頭蒿多糖的單糖組分含量均發(fā)生了不同程度的變化。其中來蘇糖的含量變化較復(fù)雜,這可能是由于來蘇糖作為含量較少的極性分子,更容易在微波熱效應(yīng)下產(chǎn)生高速振動(dòng),致使不穩(wěn)定的熱點(diǎn)產(chǎn)生從而導(dǎo)致其單糖組分含量變化復(fù)雜[28]。此外,阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖的含量呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化:單糖組分含量在30 min前呈現(xiàn)增加趨勢(shì),隨著微波提取時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)單糖組分含量明顯下降,這是因?yàn)樵诙虝r(shí)間范圍內(nèi)微波提取時(shí)間越長(zhǎng),微波作用越充分,植物細(xì)胞壁破裂導(dǎo)致多糖溶出越充分,但到達(dá)一定時(shí)間后樣品中水分被蒸干,因此時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)單糖組分出現(xiàn)下降的趨勢(shì)[29-30]。衛(wèi)強(qiáng)等[31]在紫荊花多糖的微波提取工藝優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn),在4～24 min的微波提取過程中紫荊花多糖的提取量與時(shí)間存在明顯的正相關(guān)趨勢(shì)。王一峰等[32]在微波提取工楤木根皮多糖的研究中同樣也證明了在微波提取40 min內(nèi)楤木根皮多糖的提取率明顯上升,隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)多糖提取率明顯下降。

Gharibzahedi等[33]在研究中也報(bào)道了類似的結(jié)果,其研究表明在超聲波-微波輔助提取無花果多糖的過程中各單糖組分在0～60 min范圍內(nèi)出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)。因此,可以推斷出在短時(shí)間范圍內(nèi)微波提取對(duì)ASP單糖組分含量的影響呈現(xiàn)增加趨勢(shì),并且在600 W,60 ℃的提取條件下ASP的最適提取時(shí)間在30～60 min之間。

主成分表達(dá)式:

F1=-0.24X1-0.08X2+0.219X3+0.249X4+0.257X5+0.197X5

式(1)

F2=-0.188X1+0.489X2-0.271X3-0.222X4+0.151X5+0.347X6

式(2)

根據(jù)表1中可知,在不同時(shí)間條件下微波提取的ASP中,六種單糖提取出的主要成分有兩個(gè),第一主成分特征值=3.633>1,貢獻(xiàn)率為60.549%,第二主成分的特征根=1.852>1,貢獻(xiàn)率為30.886%,兩個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率到達(dá)91.415%,即兩個(gè)主成分解釋了不同時(shí)間條件下六種單糖變化程度的91.415%,結(jié)果說明提取出兩個(gè)主成分是全面的。李莎等[34]、宋瑞琦等[35]和Aksic等[36]分別在關(guān)于單糖組成主成分分析的研究中利用主成分特征值解釋了單糖組分變化程度,證實(shí)了提取出主成分的全面性。

表1 解釋的總方差Table 1 Total variance of interpretation

表2和圖2表示了提取出的主成分與原始數(shù)據(jù)之間的相關(guān)程度,即提取出的主成分含有原始變量的數(shù)據(jù)[37]。根據(jù)文獻(xiàn)所報(bào)道,在九香蟲及相似品的多糖組成分析研究中,通過成分得分矩陣和主成分分析圖清晰反映出不同單糖組分之間的差異性,以及單糖組分的變化關(guān)系[34]。從表2中可以看出,第一主成分與甘露糖、半乳糖和葡萄糖的相關(guān)系數(shù)都接近1>0.85,說明較全面的包括了這三種單糖的變化信息,而阿拉伯糖的信息涵蓋較差。第二主成分中阿拉伯糖的相關(guān)系數(shù)接近1,說明涵蓋阿拉伯糖信息,而其他五種單糖的相關(guān)系數(shù)較低,對(duì)第二主成分的解釋程度較差。因此在不同微波提取時(shí)間下提取的ASP中,來蘇糖、木糖、甘露糖和半乳糖的變化程度比阿拉伯糖的變化幅度大。Cheng等[38]也報(bào)導(dǎo)了類似的結(jié)論,通過主成分分析法明確闡述了在決明子多糖提取過程中,微波提取時(shí)間對(duì)甘露糖和半乳糖的組分含量影響較大。因此,通過該分析方法能夠清晰的反映在不同微波提取時(shí)間條件下微波輔助提取的ASP中主要單糖組分的含量變化明顯。

表2 成分得分矩陣及成分得分系數(shù)矩陣Table 2 Component score matrix and component score coefficient matrix

圖2 不同微波提取時(shí)間條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.2 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction time

2.1.2 不同微波提取功率條件下ASP中單糖組分分析 微波提取法主要利用微波能量穿透進(jìn)入基質(zhì)內(nèi)部,然而影響微波能量大小的關(guān)鍵因素來源于微波功率的大小[16]。因此該部分主要討論不同微波提取功率對(duì)單糖組分的影響。圖3顯示了不同提取功率處理下ASP樣品中的6種單糖的含量變化趨勢(shì),且總體變化規(guī)律與不同微波提取時(shí)間條件下保持一致。研究發(fā)現(xiàn)不同點(diǎn)在于含量較低的來蘇糖組分變化規(guī)律異于其他單糖組分,其在850 W功率時(shí)含量下降,推測(cè)這是由于來蘇糖分子,在高功率的微波提取下高速振動(dòng)產(chǎn)生過高的熱量,其分子結(jié)構(gòu)遭到破壞致使其單糖組分含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)[27]。因此可以得出結(jié)論在60 min,60 ℃的提取條件下ASP的最適提取功率為400～600 W。

圖3 微波提取功率對(duì)ASP各單糖組分含量的影響Fig.3 Influence of microwave extraction power on the monosaccharide composition content of ASP

根據(jù)表3可知,與2.2.1不同的是,在不同微波提取功率條件下處理的ASP中提取出了三個(gè)主要成分并且累計(jì)貢獻(xiàn)率到達(dá)97.542%,即從三個(gè)主成分全面解釋了不同功率條件下六種單糖變化程度的97.542%。其次,根據(jù)表4和圖4主要反映出第一主成分與甘露糖和葡萄糖的相關(guān)系數(shù)都接近1>0.85,說明較全面的包括了這兩種單糖的變化信息,其中半乳糖的信息涵蓋較差。然而,第二主成分中半乳糖的相關(guān)系數(shù)接近1,說明涵蓋半乳糖信息,而其他五種單糖的相關(guān)系數(shù)較低,對(duì)第二主成分的解釋程度較差。此外,單糖組分總體變化規(guī)律與2.2.1相同,不同之處在于低含量的木糖組分變化幅度減小,因此可以推斷出改變微波提取功率對(duì)含量較高的主要單糖組分影響較大。譚等[39]在對(duì)人生花多糖的研究中發(fā)現(xiàn),改變微波提取功率其單糖組分中除鼠李糖外其他七種單糖含量的變化較大。因此,可以看出微波提取功率對(duì)多糖中含量低的單糖組分影響較小,且影響類別與程度存在底物差異性。

表3 解釋的總方差Table 3 Total variance of interpretation

表4 成分得分矩陣及成分得分系數(shù)矩陣Table 4 Component score matrix and component score coefficient matrix

圖4 不同微波提取功率條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.4 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different microwave extraction power

2.1.3 不同微波提取溫度條件下ASP中單糖組分分析 由圖5可以看出,提取溫度為40～90 ℃的過程中,隨輻照溫度的增大,單糖的組成均發(fā)生了不同程度的變化。雖然在該條件下,每種單糖的含量未呈現(xiàn)出規(guī)律性的變化,但在該提取溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高,各單糖的含量均存在一個(gè)最大值和最小值。因此可以發(fā)現(xiàn)提取溫度區(qū)間在50～70 ℃,對(duì)有效保留不同單糖組分有著明顯的作用。劉超[40]在研究中也發(fā)現(xiàn)用微波輔助提取羊肚菌胞內(nèi)多糖的過程中,在提取溫度為70 ℃的條件下半乳糖含量最高,半乳糖組分得到了有效的保留。此外,從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出提取溫度導(dǎo)致ASP單糖組分含量的變化程度均小于微波提取時(shí)間和功率。

圖5 微波提取溫度對(duì)ASP各單糖組分含量的影響Fig.5 Influence of microwave extraction temperature on the monosaccharide composition content of ASP

在不同提取溫度條件下的ASP中,提取出了兩個(gè)主要成分同2.2.1,第一主成分特征值=3.372>1,貢獻(xiàn)率為59.196%,第二主成分的特征值=1.685>1,貢獻(xiàn)率為28.087%,且累計(jì)貢獻(xiàn)率到達(dá)84.283%,即兩個(gè)主成分全面地解釋了不同提取溫度條件下六種單糖變化程度的84.283%。表6和圖6代表了提取出的主成分與原始數(shù)據(jù)之間的相關(guān)程度,即提取出的主成分含有的原始變量的數(shù)據(jù)。從表6中可以看出,第一主成分和第二主成分分別與葡萄糖和甘露糖的相關(guān)系數(shù)接近1,分別說明較全面的包括了葡萄糖和甘露糖的變化信息,而其他糖的信息涵蓋較差,并且對(duì)第二主成分的解釋程度較差。因此在不同提取溫度條件下提取的ASP中,

表5 解釋的總方差Table 5 Total variance of interpretation

表6 成分矩陣及成分得分系數(shù)Table 6 Component matrix and component score coefficient

圖6 不同溫度條件下ASP中單糖主成分荷載圖Fig.6 Principal component load diagram of monosaccharides in ASP under different extraction temperature

葡萄糖的變化程度大于甘露糖,且變化幅度明顯大于其他單糖組分。研究說明利用微波提取ASP在改變提取溫度的條件下僅對(duì)葡萄糖含量的影響最為明顯。與2.2.1和2.2.2相比,提取溫度這一因素,在微波輔助提取ASP的過程中影響權(quán)重較低。這是因?yàn)槲⒉ū旧砜梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)產(chǎn)生很大的熱能[16],破壞活性物質(zhì)的穩(wěn)定性,在一定溫度范圍內(nèi)改變提取溫度條件,對(duì)提取物質(zhì)的影響很小[17]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)微波輔助提取ASP的單糖組成及組分含量的分析結(jié)果表明隨著微波提取條件(輻照時(shí)間、輻照功率和提取溫度)的增加,各單糖組分含量均呈現(xiàn)先增加后降低的總體變化趨勢(shì)。通過SPSS對(duì)不同處理?xiàng)l件下得到的單糖組分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析研究,可以發(fā)現(xiàn)微波提取時(shí)間、功率和溫度三種影響因素均導(dǎo)致ASP中主要單糖組分含量明顯變化,其中微波提取時(shí)間的改變對(duì)單糖組分的影響最為顯著。本研究為微波輔助提取技術(shù)在多糖領(lǐng)域中的應(yīng)用及工藝優(yōu)化提供了技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支持。