血紅鉚釘菇多糖超聲微波聯(lián)合提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

岳崢嶸,趙 博,張國財,呂明帥,張方明(東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

血紅鉚釘菇[Chroogomphusrutilus(Schaeff.)O.K. Mill.]屬牛肝菌目(Boletales)鉚釘菇科(Gomphidiaceae)色釘菇屬(Chroogomphus),是一種松屬針葉樹木外生大型菌根真菌[1-2],亦是我國珍貴的傳統(tǒng)食藥用菌之一[3]。研究表明,血紅鉚釘菇富含蛋白質(zhì)[4]、多糖[5]、黃酮[6]、香豆素[7]及甾醇[8]等多種活性物質(zhì),具有極高的食用和藥用價值。

多糖作為食用菌重要的活性成分[9],具有抗腫瘤[10]、抗氧化[11]、抗疲勞[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等諸多藥理作用。然而,迄今關(guān)于血紅鉚釘菇多糖開發(fā)的研究較少,對其提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)研究亦鮮有報道。Wang等[11]以傳統(tǒng)水提法提取血紅鉚釘菇子實體粗多糖,提取時間2.5 h得率僅為6.02%±0.15%。超聲微波聯(lián)合提取法具有提取時間短[14]、對活性物質(zhì)影響較小[15]、得率高[16]等優(yōu)點,目前已在多種食藥用菌多糖提取研究中得到應(yīng)用[17-19]。

因此,本文采用響應(yīng)面法對超聲微波聯(lián)合提取血紅鉚釘菇多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化,并與超聲波提取法和傳統(tǒng)水提法的提取效果和抗氧化活性進(jìn)行比較分析,旨在提供高效血紅鉚釘菇多糖提取工藝,為其進(jìn)一步研發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

JY92-IIN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;MDS-6型微波快速制樣系統(tǒng) 上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;DID-S14型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;SHB-CIA型循環(huán)水式真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;Ultrospec 5300pro型紫外分光光度計 美國通用電氣醫(yī)療集團(tuán);Thermo Heraeus BIOFUG型高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取工藝 將新鮮的血紅鉚釘菇子實體置于烘箱中,45 ℃條件下鼓風(fēng)干燥至恒重,將烘干后的樣品粉碎過80目篩,備用。以蒸餾水為提取液,在不同提取條件下,按照先超聲后微波的操作順序,以超聲微波聯(lián)合提取法提取血紅鉚釘菇多糖,抽濾除去殘渣,取濾液以四倍量無水乙醇醇沉過夜,9000 r/min條件下離心20 min,取沉淀以Sevag法[20]除去蛋白。將除去蛋白的樣品用四倍量無水乙醇醇沉過夜,次日離心后分別用乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀,將樣品溶解后,在截流量3500 Da條件下透析48 h,濃縮透析液后進(jìn)行冷凍干燥,得血紅鉚釘菇粗多糖粉末。

1.2.2 單因素實驗 以血紅鉚釘菇粉末為原料,以超聲微波聯(lián)合提取法進(jìn)行多糖提取,研究超聲時間(5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 min)、超聲功率(390、455、520、585、650 W)、微波時間(2、5、8、11、14 min)、微波溫度(60、70、80、90、100 ℃)及液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對血紅鉚釘菇多糖得率的影響。固定提取條件為:超聲時間7.5 min,超聲功率520 W,微波時間8 min,微波溫度90 ℃、液料比30∶1 mL/g,以多糖得率作為指標(biāo)評價提取效果。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素實驗所得結(jié)果,選取對多糖得率影響較大的四個因素(超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比),選用Box-Behnken模型,對以上因素進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面設(shè)計,以多糖得率為響應(yīng)值對多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,試驗因素與水平設(shè)計見表1。各處理組重復(fù)3次,取平均值。

表1 響應(yīng)面試驗設(shè)計Table 1 Response surface design

1.2.4 多糖含量測定及得率計算方法 采用苯酚-硫酸法[21]進(jìn)行測定。線性回歸方程為:y=15.33x+0.2439(y為吸光值;x為多糖質(zhì)量濃度),R2=0.9975。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量,按公式(1)計算得多糖得率:

式(1)

式中,mt為樣品所含多糖質(zhì)量(g);mp為樣品原料粉末質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件選用Box-Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計,試驗所得數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件處理并進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

由圖1a可知,在研究超聲時間對多糖得率影響的實驗中,得率隨超聲時間的增加呈先上升后下降趨勢,且不同超聲時間下多糖得率差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)超聲時間為7.5 min時,多糖得率最高為7.61%±0.13%。

由圖1b可知,在研究超聲功率對多糖得率影響的實驗中,得率受超聲功率影響變化的幅度不大,除390和520 W兩組間存在顯著差異外(P<0.05),其余各組間差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)超聲功率為520 W時,多糖得率最高為7.37%±0.22%。

由圖1c可知,在研究微波時間對多糖得率影響的實驗中,得率隨微波時間的增加呈先上升后下降趨勢,各組之間差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)微波時間為5 min時,多糖得率最高為8.43%±0.11%。

由圖1d可知,在研究微波溫度對多糖得率影響的實驗中,得率隨微波溫度的升高呈先上升后平穩(wěn)趨勢,各組之間差異極顯著(P<0.01)。當(dāng)微波溫度為90 ℃時,多糖得率最高為7.17%±0.10%。

由圖1e可知,在研究液料比對多糖得率影響的實驗中,得率隨液料比的提高呈先上升后下降趨勢,不同液料比對多糖得率影響極顯著(P<0.01)。當(dāng)液料比為30∶1 mL/g時,多糖得率最高為7.20%±0.11%。

圖1 超聲時間(a)、超聲功率(b)、微波時間(c)、微波溫度(d)及液料比(e)對多糖得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonication time(a),ultrasonic power(b),microwave time(c),microwave temperature(d)and liquor to solid ratio(e)on polysaccharides yield注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01);字母相同表示差異不顯著(P>0.05)。

方差分析結(jié)果表明,超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比對多糖得率的影響均為極顯著(P<0.01),相比之下,超聲功率對多糖得率影響較弱,因而選用超聲時間5 min、微波時間5 min、微波溫度90 ℃、液料比30∶1 mL/g、超聲功率520 W作為提取條件較為適合。分析可知,隨著超聲時間、微波時間的提高,在一定范圍內(nèi)得率會出現(xiàn)下降情況,長時間的超聲波機(jī)械作用或微波熱效應(yīng)過強(qiáng)可導(dǎo)致部分多糖發(fā)生降解[24];而液料比在一定范圍內(nèi)得率也會下降,原因可能是提取液的增加對血紅鉚釘菇細(xì)胞內(nèi)其他活性物質(zhì)的溶出效果顯著高于多糖,細(xì)胞內(nèi)外滲透壓發(fā)生變化,從而限制到多糖的溶出。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取超聲時間、微波時間、微波溫度、液料比四個因素,采用四因素三水平進(jìn)行設(shè)計,響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 Response surface design experimental results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of varfance for the fitted quadratic polynomial model

2.2.3 各因素交互作用分析 由圖2和表3可知,超聲時間、微波時間、微波溫度和液料比4個單獨(dú)因素對多糖得率均有高度顯著影響(P<0.001);交互作用方面,AB、AC、AD和CD響應(yīng)面交互作用高度顯著(P<0.001),BC響應(yīng)面交互作用極顯著(P<0.01),BD響應(yīng)面交互作用不顯著(P>0.05)。

圖2 各因素交互作用下血紅鉚釘菇多糖得率Fig.2 Response surface plots showing the interactive effects of four extraction parameters on extraction polysaccharides

2.2.4 優(yōu)化提取工藝參數(shù)驗證 對回歸方程進(jìn)行分析可知,經(jīng)優(yōu)化所得血紅鉚釘菇多糖最佳提取工藝條件為:超聲時間7.74 min、微波時間5.64 min、微波溫度91.95 ℃、液料比28.58∶1 mL/g,得率預(yù)測值為8.77%。為便于實際操作,選取超聲時間8 min、微波時間6 min、微波溫度92 ℃、液料比29∶1 mL/g對提取工藝進(jìn)行驗證,在此條件下,重復(fù)3次試驗,得到血紅鉚釘菇多糖得率為8.69%±0.19%,與預(yù)測值相近,說明模型預(yù)測較為準(zhǔn)確。

2.3 不同提取方法的血紅鉚釘菇多糖體外抗氧化能力比較

2.3.1 血紅鉚釘菇多糖對總還原力的影響 由圖3a可知,在0.5～5.0 mg/mL濃度梯度下,由三種方法提取的血紅鉚釘菇多糖均具有還原能力,OD值均隨著多糖濃度的提高而增大,其中,超聲微波聯(lián)合提取法獲得多糖的還原力最強(qiáng),超聲提取法次之,傳統(tǒng)水提法所得多糖還原力最弱。在多糖濃度為5 mg/mL條件下,三者吸光值分別為1.24、0.71和0.40,且三種提取方法對血紅鉚釘菇多糖還原力影響差異顯著(P<0.05)。

2.3.2 血紅鉚釘菇多糖對·OH清除率的影響 由圖3b可知,在0.5～6.0 mg/mL濃度梯度下,超聲提取法及超聲微波聯(lián)合提取法所得多糖對·OH清除率的影響隨多糖濃度的上升呈先上升后趨于平穩(wěn)變化,水提法所得多糖清除率始終呈緩慢上升趨勢。在選取濃度范圍內(nèi),超聲微波聯(lián)合提取法所得多糖對·OH清除效果最好,超聲提取法次之,傳統(tǒng)水提法所得多糖對·OH清除效果最弱,IC50依次為1.62、2.37和5.43 mg/mL,且三種提取方法所得多糖對·OH清除率影響均呈顯著差異(P<0.05)。

2.3.3 血紅鉚釘菇多糖對DPPH自由基清除率的影響 由圖3c可知,在0.1～0.8 mg/mL濃度梯度下,三種方法所得多糖對DPPH清除率的影響均隨多糖濃度的上升呈逐漸上升趨勢,且具有較強(qiáng)清除能力,超聲微波聯(lián)合提取法所得多糖在0.7 mg/mL濃度條件下,清除率達(dá)82.26%,其余兩種提取方法所得多糖在0.5 mg/mL濃度條件下,清除率也均超過50%,清除效果由強(qiáng)至弱依次為超聲微波聯(lián)合提取法、超聲提取法、傳統(tǒng)水提法,DPPH清除率IC50值分別為0.29、0.38和0.48 mg/mL,且對DPPH清除率影響呈顯著差異(P<0.05)。

2.3.4 血紅鉚釘菇多糖對ABTS自由基清除率的影響 由圖3d可知,三種方法所得多糖對ABTS清除率亦呈現(xiàn)隨多糖濃度上升逐漸提高的規(guī)律,與DPPH相比,所得多糖對ABTS清除能力相對較弱,在3～21 mg/mL濃度梯度下,清除效果由強(qiáng)至弱依次為超聲微波聯(lián)合提取法、超聲提取法、傳統(tǒng)水提法,ABTS清除率IC50值分別為10.28、12.92和17.59 mg/mL,且不同提取方法對ABTS清除率差異顯著(P<0.05)。

圖3 不同提取方法所得血紅鉚釘菇多糖體外抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity in vitro of polysaccharides from Chroogomphus rutilus by different extraction techniques注:a. 總還原力;b. ·OH清除能力;c. DPPH自由基清除能力;d. ABTS自由基清除能力;清除能力。

2.4 不同提取方法差異比較

表4 不同提取方法提取效果比較分析Table 4 Comparative analysis of extraction effects of different extraction methods

3 結(jié)論