一株木防己擬盤多毛孢的鑒定及其次生代謝產(chǎn)物分析

龍奧亞,閆淑珍,陳雙林(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇南京 210023)

擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)是1994年由Steyaert建立命名的一類具有重要經(jīng)濟價值的無性型真菌[1]。1996年,Strobel等從落羽杉的內(nèi)生真菌Pestalotiopsismicrospora液體發(fā)酵產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)能夠抗癌的物質(zhì)紫衫醇之后,該屬真菌成為研究真菌代謝產(chǎn)物的重要物種[2]。據(jù)報道,已從擬盤多毛孢屬中分離得到約200多種化合物,包括萜類、酯類、醌類、香豆素類、多肽類、內(nèi)酯類、生物堿及色酮類化合物等[3]。擬盤多毛孢屬真菌的代謝產(chǎn)物復(fù)雜多樣,除常見的化合物外,也分離得到許多結(jié)構(gòu)新穎且活性顯著的代謝產(chǎn)物。Lei等[4]從分離自海綿Phakelliafusca的異角狀擬盤多毛孢Pestalotiopsisheterocornis發(fā)酵物中分離得到2個化合物,分別是heterocornol C和heterocornol G。heterocornol C對人肺癌細胞H460有抑制作用,IC50值為18.7 μmol/L,陽性對照阿霉素的IC50值為1.48 μmol/L。heterocornolG對人胃癌細胞BGC-823、人前列腺癌細胞PC-3和人肝癌細胞SMMC-7721有抑制作用,IC50值分別為15.0、21.3、20.2 μmol/L,陽性對照阿霉素的IC50值分別為1.48、1.80、2.24 μmol/L。Zhang等[5]從一株未鑒定的Pestalotiopsissp. ZJ-2009-7-6發(fā)酵液中分離得到腦苷類化合物(4E,8E)-N-D-2′-hydroxypalmitoyl-1-O-β-D-glycopyranosly-9-methyl-4,8-sphingadienine,對單純皰疹病毒(HSV)及腸道病毒71(EV71)均表現(xiàn)出抑制活性,IC50分別達到16.1和74.3 μmol/L。Kuang等[6]從一株未鑒定的Pestalotiopsissp. M-23固體發(fā)酵物中分離得到1個drimane類倍半萜化合物11-dehydro-3a-hydroxyisodrimeninol,對枯草芽胞桿菌表現(xiàn)出抑制活性,IC50值為280.27 μmol/L。Xia等[7]從分離自蘆葦?shù)臄M盤多毛孢菌Pestalotiopsissydowiana發(fā)酵物中分離得到pestalotiopyrone G,表現(xiàn)出強蛋白酶抑制活性,IC50為(1.2±0.3) μmol/L,陽性對照環(huán)氧霉素的IC50值為0.072 μmol/L。

擬盤多毛孢屬真菌,分布廣泛,至今已報道了200多個種的名稱[3]。其模式菌種為葡萄盤多毛孢Pestalotiposisperioides,分生孢子具有6個細胞,中間4個細胞著色較深,兩端為無色透明細胞,具有2根及以上頂生附屬絲[8]。相近的屬有盤多毛孢屬(Pestalotia)、五隔盤單毛孢屬(Seiridium)、盤單毛孢屬(Monochaetia)、截盤多毛孢屬(Truncatella)[9]。擬盤多毛孢屬與相近的屬在分生孢子數(shù)目、顏色;附屬絲、載孢器等方面形態(tài)特征相近,增加了分類的難度。擬盤多毛孢屬真菌擁有豐富的活性代謝產(chǎn)物,包括抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒和抗寄生蟲活性等,已成為很多活性代謝產(chǎn)物的主要來源[10]。由于鑒定到種比較困難,多數(shù)報道都是以未知種的名稱出現(xiàn),超過一半的擬盤多毛孢屬真菌尚未有代謝產(chǎn)物方面的報道。因此,目前對于擬盤多毛孢屬真菌資源的鑒定和代謝產(chǎn)物研究尤為重要。

本研究對16072314菌株進行分類學(xué)鑒定和次生代謝產(chǎn)物分析。為促進擬盤多毛孢屬真菌的資源開發(fā)與利用和獲得具有高經(jīng)濟價值的真菌代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

16072314菌株 分離自葡萄狀枝瑚菌子實體,由本實驗室保藏;葡萄糖、瓊脂條 上海生工生物技術(shù)有限公司;馬鈴薯、大米 江蘇南京亞東新城華潤蘇果超市;食用菌栽培袋 湖北京山縣新市鎮(zhèn)成林菌業(yè)店;PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200.0,葡萄糖20.0,瓊脂條20.0;大米培養(yǎng)基(g/袋):200.0,pH自然,121 ℃滅菌30 min,每隔12 h滅菌1次,共滅菌2次;ITS-PCR擴增引物(ITS1、ITS4)、PCR mix(2×Taq mix) 上海生工生物技術(shù)有限公司;柱色譜用硅膠和薄層色譜用硅膠GF254(200～300目,50～71 μm) 青島海洋化工廠生產(chǎn);羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 上海源葉生物科技有限公司;薄層層析硅膠GF254200～300目 青島海洋化工廠;甲醇色譜級 美國天地有限公司;二氯甲烷、石油醚等分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;GXZ型智能光照培養(yǎng)箱 南京同立實驗儀器有限公司;C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀 美國伯樂公司;Power Pac 2000電泳儀 美國伯樂公司;Tanon-3500凝膠成像系統(tǒng) 上海天能公司;CA-1390-1垂直層流潔凈超凈臺 上海凈化設(shè)備有限公司;DHZ-C大容量恒溫振蕩器 江蘇太倉實驗設(shè)備廠;BX53F顯微鏡 日本Olympus公司;1220型分析型高效液相、1100與1200系列制備型高效液相、1290 Infinity LC/6460 QQQ MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;AVANCE III HD 400型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標) 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 采用轉(zhuǎn)接法:用滅菌的接種環(huán)從本實驗室保藏16072314菌株的試管斜面上挑取少量菌絲,在含有PDA培養(yǎng)基的平板中劃線接種。置于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d后,挑取單菌落重新接種于PDA培養(yǎng)基中進行活化。從活化好的16072314菌株的平板中,挑取一塊長勢均勻1 cm×1cm的菌塊,轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基的平板上,將培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中在26 ℃下培養(yǎng),觀察并記錄菌落的形態(tài)特征。

采取直接挑取制片法:以蒸餾水為浮載劑,用滅菌的解剖針在16072314菌株26 ℃,培養(yǎng)7 d后的平板菌落中挑取小黑點,小氣泵輕輕吹散,使孢子分散均勻,制成玻片;同時用滅菌的解剖針輕輕挑取靠近培養(yǎng)基下層的小黑點,用滅菌的解剖刀輕輕切片,制成玻片;分別在顯微鏡下觀察分生孢子和載孢器并記錄。

1.2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法[11]提取真菌基因組DNA并作為模板,以通用引物:ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對菌株進行ITS區(qū)域擴增。PCR反應(yīng)體系為:12.5 μL PCR mix(2×Taq mix),10 μmol/L ITS1,ITS4各1 μL,DNA模板1 μL,加無菌水至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性30s,55 ℃退火45s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次,72 ℃溫育10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳,紫外燈下檢測。測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。使用SeqMan(DNAStarInc,USA)軟件仔細對照測序峰圖與堿基序列進行檢查分析和校正后,用BLAST軟件在GenBank(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/BLAST)中進行同源性比對,選取有詳細信息的參考菌株和外群菌株,Mega7.0做Clust W多重比對分析,并進行1000次自檢,構(gòu)建NJ(Neighbor-Joining,NJ)系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 菌株發(fā)酵 保藏菌種接種到PDA培養(yǎng)基平板上,26 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑取3個活化后的長勢均勻1 cm×1 cm大小的菌塊,轉(zhuǎn)接到裝有100 mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,26 ℃下180 r/min搖床培養(yǎng)3～5 d。取種子液并用無菌水配成濃度為1×104個/mL的菌懸液。取10 mL上述菌懸液轉(zhuǎn)接于裝有大米固體培養(yǎng)基的17×35×5 cm3栽培袋中,混勻于26 ℃靜止培養(yǎng)35 d,共發(fā)酵20袋。發(fā)酵產(chǎn)物于55 ℃下烘干,粉碎并稱重以備用。

1.2.4 產(chǎn)物的分離與純化 將烘干粉碎后的固體發(fā)酵料用甲醇浸提至無色,減壓濃縮,獲得粗提物41.92 g。粗體物經(jīng)硅膠柱色譜分離,以二氯甲烷/甲醇(19∶1、17∶3、13∶7、1∶1、9∶1)梯度洗脫,TLC檢測并進行合并,得到F1～F5五個部分。F1部分重結(jié)晶得到化合物3(20 mg)。F2部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1)梯度洗脫,其中9∶1部分經(jīng)重結(jié)晶得到化合物7(12 mg),1∶1部分經(jīng)制備薄層色譜分離得到化合物1(16 mg)。F3部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜,以石油醚/乙酸乙酯(9∶1,4∶1,7∶3,3∶2,1∶1)梯度洗脫,其中9∶1部分經(jīng)半制備高效液相色譜分離得到化合物5(12 mg),7∶3部分經(jīng)半制備高效液相色譜分離得到化合物4(28 mg)。F4部分反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜,以二氯甲烷/甲醇(100∶1～10∶1)梯度洗脫,其中90∶1部分經(jīng)Sephadex LH-20分離和半制備高效液相色譜分離到化合物6(21 mg),40∶1部分經(jīng)半制備高效液相色譜分離得到化合物2(12 mg)。F5部分經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20分離和半制備高效液相色譜得到化合物8(10 mg)。

1.2.5 結(jié)構(gòu)鑒定 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀和核磁共振波譜儀對化合物的結(jié)構(gòu)進行鑒定。液相色譜條件:色譜柱:SunFireTMC18反相色譜柱(4.6×250 mm,5 μm);流動相比例:70%色譜甲醇;流速:0.6 mL/min;進樣量:20 μL;二極管陣列檢測器波長:254 nm;柱溫箱5～95 ℃;工作壓力0～15000 psi;控溫自動進樣器:4～60 ℃;質(zhì)譜條件:離子源:電噴霧離子化源(ESI);模式:正、負離子模式;掃描范圍:m/z為5～3000;分辨率:R≥2.5 M。核磁條件:根據(jù)AVANCE III HD 400型核磁共振儀的相應(yīng)參數(shù)設(shè)置,TMS為內(nèi)標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件處理,獲得各化合物的分子量信息。核磁共振波譜數(shù)據(jù)通過MestReNova軟件處理,獲得相應(yīng)的1H-NMR和13C-NMR信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的菌落形態(tài)和顯微特征

PDA培養(yǎng)基上白色菌落生長蓬松,棉絮狀,背面無色素積淀,約7 d后菌落里面和菌絲表面出現(xiàn)散落的小黑點即分生孢子堆。載孢體為分生孢子盤,表皮下生,由淺褐色薄壁角細胞組成,直徑100～240 μm。分生孢子紡錘形,直或稍彎曲,大小為(20～26) μm×(5～6.1) μm;5個細胞,中間3個細胞暗色,較大,近圓柱形;兩端細胞無色,較小,近三角形。頂端附屬絲2～3條,多數(shù)3條、長5～17.8 μm,基部附屬絲2.5～5 μm(圖1)。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察,參考宋玉等[12]對擬盤多毛孢屬真菌形態(tài)特征描述的特點,初步確定16072314菌株為擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)真菌。

圖1 16072314菌株的形態(tài)和顯微特征Fig.1 Morphology and microscopic characteristics of the 16072314 strain注:A:PDA培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(正面)；B:PDA培養(yǎng)基中菌落形態(tài)(背面)。C:分生孢子顯微特征(40×);D:分生孢子器顯微特征(40×);標尺:C=10 μm;D=50 μm。

2.2 基于ITS序列的菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

通過PCR方法擴增16072314菌株的ITS區(qū),獲得目的片段414 bp,上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的序列號為:MT364494。采用BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄序列比對,結(jié)果獲得16072314菌株的ITS區(qū)序列與序列號LC206587.1的木防己擬盤多毛孢一致性高達100%。根據(jù)NJ系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn):16072314菌株與木防己擬盤多毛孢聚在同一分支中,自檢支持率達95%。整個系統(tǒng)發(fā)育樹成為4個大的分支,外群Robillardasessilis作為一個單獨分支,2株P(guān)estalotiopsisvismiae和2株P(guān)estalotiopsismicrospora以97%的自檢支持率聚在同一分支;3株P(guān)estalotiopsiscamelliae以99%的自檢支持率聚在同一分支(圖2)。

圖2 根據(jù)ITS序列建立的擬盤多毛孢屬內(nèi)種間的分子系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree established according to 16072314 strain’s ITS sequence

綜合形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)檢測結(jié)果,以吳文能等[13]和秦紹釗等[14]對木防己擬盤多毛孢的形態(tài)學(xué)描述為參照,確定16072314菌株的分類學(xué)地位為擬盤多毛孢屬的木防己擬盤多毛孢Pestalotiopsiscocculi。擬盤多毛孢屬的大多數(shù)種,一般以植物內(nèi)生真菌的形式存在,或者以植物病原菌、腐生菌的形式存在。少數(shù)從動物體表中分離得到,例如古玉等[15]從大熊貓體表分離得到一株海南擬盤多毛孢Pestalotiopsishainanensis。目前尚未有在食用菌子實體中分離得到的報道。

2.3 化合物結(jié)構(gòu)的波譜鑒定

共分離、鑒定出8個成分,在粗提物中的提取率分別為7-羥基香豆素(0.38%)、阿魏酸(0.29%)、麥角甾醇(0.48%)、對羥基苯甲醛(0.67%)、對羥基苯乙醇(0.29%)、齊墩果酸(0.5%)、β-谷甾醇(0.29%)和過氧麥角甾醇(0.24%)?；衔锝Y(jié)構(gòu)見圖3。

圖3 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structures of compounds 1～8

化合物1:淺黃色粉末,ESI-MS:m/z 185.1[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 10.55(1H,s,-OH),7.93(1H,d,J=9.4 Hz,H-4),7.53(1H,d,J=8.5 Hz,H-5),6.79(1H,dd,J=8.4,2.3 Hz,H-6),6.72(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),6.20(1H,d,J=9.4 Hz,H-3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 102.6(C-3),111.7(C-8),111.9(C-10),113.6(C-6),130.2(C-5),145.0(C-4),156.0(C-7),160.9(C-9),161.7(C-2)。上述NMR數(shù)據(jù)與文獻[16]對照一致,鑒定為7-羥基香豆素。

化合物2:白色粉末,ESI-MS:m/z 193.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.53(1H,s,4-OH),7.49(1H,d,J=15.9 Hz,H-7),7.28(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),7.08(1H,dd,J=8.2,2.0 Hz,H-6),6.79(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.36(1H,d,J=16.0 Hz,H-8),3.82(3H,s,-OCH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 56.1(-OCH3),111.4(C-2),115.8(C-5),116.0(C-8),123.2(C-6),126.2(C-1),145.3(C-7),148.3(C-3),149.3(C-4),168.8(C-9)。上述NMR數(shù)據(jù)與文獻[17]對照一致,鑒定為阿魏酸。

化合物3:白色針狀結(jié)晶(石油醚),ESI-MS:m/z 419.3[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.59(1H,dd,J=5.7,2.5 Hz,H-6),5.40(1H,dt,J=5.6,2.8 Hz,H-7),5.31-5.01(2H,m,H-22,23),3.74-3.47(1H,m,H-3),1.06(3H,d,J=6.7 Hz,H-21),0.97(3H,s,H-19),0.94(3H,d,J=6.8 Hz,H-28),0.85(3H,d,J=6.5 Hz,H-27),0.84(3H,d,J=6.8 Hz,H-26),0.65(3H,s,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 12.0(C-18),16.3(C-19),17.6(C-28),19.6(C-27),19.9(C-26),21.1(C-21,11),23.0(C-15),28.3(C-16),32.0(C-2),33.1(C-25),37.0(C-10),38.4(C-1),39.1(C-12),40.4(C-20),40.8(C-4),42.8(C-13,24),46.2(C-9),54.5(C-14),55.7(C-17),70.5(C-3),116.3(C-7),119.6(C-6),132.0(C-23),135.6(C-22),139.8(C-5),141.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]相同,鑒定為麥角甾醇。

化合物4:黃色粉末,ESI-MS:m/z 121.0[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.79(s,1H,-CHO),7.76(d,J=8.7 Hz,2H,H-2,6),6.94(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 191.4(-CHO),163.8(C-4),132.6(C-2,6),128.8(C-1),116.3(C-3,5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]相同,鑒定為對羥基苯甲醛。

化合物5:白色粉末,ESI-MS:m/z 137.1[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 9.12(s,1H,-OH),6.99(d,J=8.5 Hz,2H,H-2,6),6.66(d,J=8.5 Hz,2H,H-3,5),4.57(t,J=5.2 Hz,1H,-OH),3.52(td,J=7.3,5.3 Hz,2H,H-8),2.60(t,J=7.3 Hz,2H,H-7)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ155.9(C-4),130.1(C-2,6),129.9(C-1),115.4(C-3,5),63.1(C-8),38.7(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]相同,鑒定為對羥基苯乙醇。

化合物6:白色粉末,ESI-MS:m/z 479.0[M+Na]+。1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ 5.17(d,J=4.0 Hz,1H,H-12),3.03(m,1H,H-3),2.75(dd,J=13.9,4.5 Hz,1H,H-18),1.10,0.90,0.88,0.87,0.86,0.72,0.68(s,21H,7×CH3)。13C NMR(DMSO-d6,100 MHz)δ 15.6(C-24),16.5(C-25),17.3(C-26),18.5(C-6),23.1(C-11),23.4(C-16),23.8(C-30),26.1(C-27),27.4(C-2),27.7(C-15),28.7(C-23),30.9(C-20),32.6(C-22),32.9(C-7),33.3(C-29),33.8(C-21),37.1(C-10),38.5(C-1),38.8(C-4),39.3(C-8),41.3(C-18),41.8(C-14),45.9(C-19),46.1(C-17),47.5(C-9),55.3(C-5),77.3(C-3),122.0(C-12),144.3(C-13),179.0(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]相同,鑒定為齊墩果酸。

化合物7:白色針狀結(jié)晶(氯仿),ESI-MS:m/z 437.2[M+Na]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 5.37(m,1H,H-6),3.55(m,1H,H-3),1.03(s,3H,H-19),0.93(d,J=6.5,3H,H-21),0.83-0.88(9H,H-26,27,29),0.70(s,3H,H-18)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 11.9(C-29),12.0(C-18),18.8(C-21),19.0(C-27),19.4(C-19),19.8(C-26),21.1(C-11),23.1(C-28),24.3(C-15),26.1(C-23),28.3(C-16),29.1(C-25),31.7(C-2),31.9(C-7),31.9(C-8),33.9(C-22),36.2(C-20),36.5(C-10),37.3(C-1),39.8(C-12),42.3(C-4),42.3(C-13),45.8(C-24),50.1(C-9),56.1(C-17),56.8(C-14),71.8(C-3),121.7(C-6),140.8(C-5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]相同,鑒定為β-谷甾醇。

化合物8:白色針狀結(jié)晶(丙酮),ESI-MS:m/z 429.3[M+H]+。1H NMR(CDCl3,400 MHz)δ 6.53(d,J=8.5 Hz,1H,H-7),6.26(d,J=8.5 Hz,1H,H-6),5.24(dd,J=15.2,7.4 Hz,1H,H-22),5.16(dd,J=15.3,8.2 Hz,1H,H-23),3.99(m,1H,H-3),1.02(d,J=6.6 Hz,3H,H-21),0.93(d,J=6.8 Hz,3H,H-28),0.90(s,3H,H-19),0.85(d,J=6.6 Hz,3H,H-27),0.84(s,3H,H-18),0.83(d,J=6.6 Hz,3H,H-26)。13C NMR(CDCl3,100 MHz)δ 135.4(C-6),135.2(C-22),132.3(C-23),130.8(C-7),82.2(C-5),79.4(C-8),66.5(C-3),56.2(C-17),51.7(C-14),51.1(C-9),44.6(C-13),42.8(C-24),39.8(C-20),39.3(C-12),37.0(C-4),36.9(C-10),34.7(C-1),33.1(C-25),30.1(C-2),28.7(C-15),23.4(C-11),20.9(C-16),20.6(C-21),20.0(C-27),19.7(C-26),18.2(C-19),17.6(C-28),12.9(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]相同,鑒定為過氧麥角甾醇。

從木防己擬盤多毛孢固體發(fā)酵物甲醇浸膏中提取的物質(zhì),主要可以分為酚酸類、甾醇類及三萜類化合物。阿魏酸屬于酚酸類化合物,提取率為0.29%。阿魏酸僅在少數(shù)其他真菌[24]代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn),鑒于此,16072314菌株可以作為工業(yè)化生產(chǎn)阿魏酸的潛力菌種。麥角甾醇、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇屬于甾類化合物,提取率分別是0.48%、0.29%和0.24%。而Xing等[25]從異角狀擬盤多毛孢Pestalotiopsishetercornis大米固體發(fā)酵物中分離得到麥角甾醇、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇,提取率分別是0.15%、0.12%和0.11%。齊墩果酸屬于三萜類化合物,提取率為0.5%,王艷穎等[26]從番石榴葉內(nèi)生真菌Pestalotiopsiszonata液體發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到齊墩果酸,提取率為0.38%。通過與擬盤多毛孢真菌屬類似研究中的提取率相比,本研究中甾醇類及三萜類化合物的提取率均有所提高,為木防己擬盤多毛孢真菌資源的利用提供可靠依據(jù)。

3 結(jié)論

本研究采用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合ITS序列分析法將16072314菌株鑒定為木防己擬盤多毛孢,該菌株為首次從食用菌子實體中分離得到。綜合運用多種天然產(chǎn)物分離技術(shù)對木防己擬盤多毛孢次生代謝產(chǎn)物進行分離純化,得到了高純度的8種化合物,分別是7-羥基香豆素、阿魏酸、麥角甾醇、對羥基苯甲醛、對羥基苯乙醇、齊墩果酸、β-谷甾醇和過氧麥角甾醇。8個化合物均為首次從木防己擬盤多毛孢中分離得到,阿魏酸在擬盤多毛孢屬真菌中為首次發(fā)現(xiàn)。本文明確了木防己擬盤多毛孢的化學(xué)成分,為評價其生物活性和應(yīng)用前景提供了科學(xué)依據(jù)。