不同原料組成對(duì)黏豆包酸面團(tuán)的真菌菌群及流變學(xué)特性的影響

韓雨茜,蘆 淋,郭 鸰(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150030)

黏豆包是我國(guó)東北地區(qū)廣受歡迎的一種特色主食。它口感獨(dú)特,營(yíng)養(yǎng)豐富,含有膳食纖維,是各地民眾喜愛的休閑健康食品和節(jié)日食品[1]。傳統(tǒng)黏豆包的原料多以江米、黏玉米、黃米等單獨(dú)或輔以其他谷物為主,以自然發(fā)酵形成的酸面團(tuán)生產(chǎn)制作而成。家庭或作坊的生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)方式使得黏豆包生產(chǎn)加工過程中存在較大的食品質(zhì)量和安全隱患，影響?zhàn)ざ拱漠a(chǎn)品品質(zhì)和貨架期,限制其在全中國(guó)的廣泛生產(chǎn)銷售。因此,研究如何提升黏豆包的品質(zhì),對(duì)推進(jìn)東北黏豆包產(chǎn)業(yè)化和高值化利用并豐富百姓的日常飲食具有一定意義。

酸面團(tuán)中的真菌,尤其是酵母菌在自然發(fā)酵過程中的發(fā)酵起到重要作用。許多研究已經(jīng)揭示了真菌在發(fā)酵過程中的作用[2-3]。近年來有很多對(duì)于江米、玉米等雜糧為原料制作的酸面團(tuán)中真菌的研究。姚笛等[4]和陶東婭等[5]均以黃米和玉米混合為原料的黏豆包酸面團(tuán)為研究對(duì)象,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE)探究其中真菌多樣性均發(fā)現(xiàn)酵母菌為主要真菌,且姚笛等人推測(cè)釀酒酵母為優(yōu)勢(shì)菌種。烏日娜等[6]以玉米酸面團(tuán)為研究對(duì)象,利用PCR-DGGE技術(shù)探究了其中微生物菌群多樣性發(fā)現(xiàn)在9份酸面團(tuán)中共鑒定出14種真菌。Li等[7]采用純培養(yǎng)方法和PCR-DGGE技術(shù)研究分別以玉米和大米為原料酸面團(tuán)的微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)Wickerhamomycesanomalus,Saccharomycescerevisiae和Torulasporadelbrueckii為這兩種酸面團(tuán)的主要真菌。趙崢[8]分別研究了以玉米、大米和小麥為原料酸面團(tuán)的真菌多樣性發(fā)現(xiàn)酸面團(tuán)中的真菌主要是威克漢姆酵母和釀酒酵母。Moroni等[9]在蕎麥或苔麩粉為原料的酸面團(tuán)中檢測(cè)到釀酒酵母和光滑假絲酵母為優(yōu)勢(shì)酵母。Park等[10]和Lim等[11]采用PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母是以江米為原料酸面團(tuán)的優(yōu)勢(shì)真菌。Akihito等[12]證明了釀酒酵母為黑麥酸面團(tuán)的優(yōu)勢(shì)真菌。然而,這些研究受到當(dāng)?shù)鼐用裆罘绞胶惋嬍辰Y(jié)構(gòu)的局限,大多研究單一原料或組合制作的酸面團(tuán),關(guān)于不同原料組合在發(fā)酵過程中對(duì)酸面團(tuán)真菌菌群構(gòu)成和流變學(xué)特性的影響的研究較少。且以往的研究大多單獨(dú)采用PCR-DGGE技術(shù),其靈敏度高、費(fèi)用較低,且能檢測(cè)到酸面團(tuán)等體系中優(yōu)勢(shì)菌種[13],但由于檢測(cè)限的限制,不能全面的反映體系中微生物菌群構(gòu)成[14]。為獲得更全面的微生物多樣性分析,實(shí)現(xiàn)微生物類群(包括低豐度的類群)的準(zhǔn)確鑒定,高通量測(cè)序技術(shù)正被廣泛地應(yīng)用于酸面團(tuán)微生物生態(tài)學(xué)研究[15-16]。但目前大多數(shù)的高通量測(cè)序結(jié)果仍只能精確到屬水平,在種水平上的微生物鑒定還相對(duì)欠缺。因此,將這兩種方法結(jié)合起來,對(duì)酸面團(tuán)發(fā)酵過程中真菌菌群構(gòu)成有一個(gè)更全面和深入的詮釋。

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)與PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合的方式探究不同原料組成對(duì)黏豆包酸面團(tuán)中的真菌菌群結(jié)構(gòu)的影響,同時(shí)探究不同原料組成對(duì)流變學(xué)特性和pH、總滴定酸度(TTA)的影響,并分析酸面團(tuán)中的真菌菌群結(jié)構(gòu)與流變學(xué)特性、pH及TTA之間的相關(guān)性,以尋找可以為產(chǎn)品提供較好產(chǎn)品品質(zhì)的黏豆包原料組成和進(jìn)一步開發(fā)直投式發(fā)酵劑,從而為黏豆包產(chǎn)品的推廣和普及奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

江米(圓糯米) 黑龍江佳木斯市樺川縣;大米(五常大米) 黑龍江五常市;黃米(糯黃米) 吉林松原市乾安縣;黏玉米(黃黏玉米) 黑龍江大慶市大同區(qū);2×Taq PCR Master Mix(含染料) 天根生化科技有限公司;D2000 天根生化科技有限公司;雙丙烯酰胺 北京博奧拓達(dá)科技有限公司;過硫酸銨 天津市博迪化工有限公司;DNA Marker I(2000 bp) 西隴化工股份有限公司。

PL203型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;HVE-50全自動(dòng)高壓滅菌鍋 Hirayama;TCL-16C離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;ABI-9700PCR擴(kuò)增儀 美國(guó)ABI公司;DYY-10C型電泳儀 北京市六一儀器廠;UVP凝膠呈相系統(tǒng)和變性梯度凝膠(DGGE)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;紫外可見透射反射儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;DELTA 320 pH計(jì) 梅特勒-托利多集團(tuán);馬爾文流變儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黏豆包酸面團(tuán)收集 從2016年11月到2017年4月期間,收集黑龍江省16戶家庭手工制成黏豆包酸面團(tuán)樣品,按照原料組成分組,樣品的材料及比例如表1所示。

表1 黏豆包發(fā)酵面團(tuán)的分組情況Table 1 Grouping for fermented sourdough samples

1.2.2 高通量測(cè)序技術(shù)分析酸面團(tuán)中真菌多樣性

1.2.2.1 DNA的提取、純化和擴(kuò)增 采用天根深加工食品DNA提取試劑盒(DP326)提取黏豆包發(fā)酵酸面團(tuán)樣品的總DNA[17-18],以引物ITS5-1737F/ITS2-2043R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC)擴(kuò)增真菌ITS區(qū)域。擴(kuò)增采用30 μL反應(yīng)體系:15 μL的2×Phusion Master Mix(含GC緩沖液),1 μL的Primer(6 μmol/L),10 μL的gDNA(5～10 ng/μL)用去離子水稀釋至30 μL。反應(yīng)參數(shù):98 ℃預(yù)變性1 min,98 ℃變性10 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。對(duì)所得的PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。使用Thermo Scientific公司的GeneJET膠回收試劑盒回收目標(biāo)條帶。

1.2.2.2 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析 用Illumina HiSeq 2500對(duì)26S rDNA基因的ITS區(qū)進(jìn)行測(cè)序得到樣品基因文庫(kù),使用QIIME(version 1.8.0)軟件中的 UCLUST[19]對(duì)Tags進(jìn)行聚類(相似度水平為97%)、獲得操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋,獲得分類學(xué)信息并分別在各個(gè)分類水平:kingdom(界),phylum(門),class(綱),order(目),family(科),genus(屬),species(種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落構(gòu)成。各樣品的數(shù)據(jù)經(jīng)過均一化處理后用于后續(xù)分析:使用QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)(Chao1、Simpson、Shannon和ACE)評(píng)估當(dāng)前的測(cè)序量能否代表主要真菌菌群的多樣性;在線進(jìn)行LEfSe分析(http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/)以觀測(cè)組間差異顯著的物種,默認(rèn)設(shè)置LDA Score的篩選值為4。

用R軟件(R3.1.1)和pheatmap函數(shù)進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析,以確定真菌物種與環(huán)境因子之間的相關(guān)性。

1.2.3 PCR-DGGE技術(shù)分析酸面團(tuán)中真菌及酵母的多樣性

1.2.3.1 DNA的提取、純化和擴(kuò)增 DNA的提取、純化同1.2.2.1。擴(kuò)增真菌26S rDNA D1區(qū)域使用引物NL1/LS2(NL1:GCCATATCAATAAGCGGAGGAAA AG,LS2:ATTCCCAAACAACTCGACTC)[4]和GC夾序列(CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC,GTCCCGCCGCC CCCGCCCG)[20]。擴(kuò)增采用PCR體系50 μL:4 μL模板DNA,1 μL的NL1-GC2,1 μL的LS2,25 μL的2×Taq PCR Master Mix(含染料)用去離子水稀釋至50 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性1 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。對(duì)PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),用符合要求的PCR產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。黏豆包酸面團(tuán)中的特異性酵母菌的26S rDNA D1區(qū)采用引物對(duì)NL1/NL4(NL1:GCCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG,NL4:GGTCCG TGTTTCAAGACGG)[21]和GC夾序列(CGCCCGCCGC GCCCCGCGCCC,GTCCCGCCGCC CCCGCCCG)[22]進(jìn)行擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序同真菌26S rDNA D1區(qū)域采用的PCR體系。

1.2.3.2 酸面團(tuán)中真菌及特異性酵母的26S rDNA D1區(qū)PCR-DGGE分析 DNA擴(kuò)增的PCR-DGGE分析選用8%的變性凝膠,凝膠梯度為35%～70%。電泳條件:上樣量為40 μL,1×TAE電泳緩沖液,60 ℃,電壓130 V,電泳8 h。電泳結(jié)束后,膠樣用GeneFinder核酸染料染色30 min。UVP凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It310,美國(guó)Bio-Rad公司)成像后分析。將DGGE圖譜中清晰、亮度較高且分離較明顯的條帶切下,裝入無菌EP管中。將切好的膠塊用100 μL去離子無菌水清洗2～3次,再加入50 μL去離子無菌水將膠塊搗碎,在4 ℃條件下過夜取其上清液作為模板,真菌和特異性酵母菌26S rDNA D1區(qū)分別采用NL1/LS2和NL1/NL4引物對(duì)對(duì)DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR體系及條件同1.2.3.1節(jié)。最后,將PCR產(chǎn)物送蘇州金唯智測(cè)序公司進(jìn)行基因測(cè)序,測(cè)序結(jié)果對(duì)比GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析。

1.2.4 酸面團(tuán)流變學(xué)特性分析 生酸面團(tuán)和熟酸面團(tuán)(熟制條件:沸水蒸制 20 min)于室溫下測(cè)定其流變學(xué)特性。將酸面團(tuán)制成3 cm×3 cm×3 cm的條狀后用保鮮膜封好,置于兩塊平板之間靜置20 min。使用馬爾文流變儀(DHR-2,英國(guó)馬爾文儀器有限公司)測(cè)定其流變學(xué)特性,測(cè)定條件[23]:溫度25 ℃,應(yīng)力1%,頻率范圍在0.1～20 Hz。按Balestra等[24]的方法對(duì)頻率在1.075 Hz時(shí)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.5 pH及總滴定酸度(TTA)的測(cè)定 酸面團(tuán)pH及TTA的測(cè)定參考趙烜影等[25]的方法。將10.0 g酸面團(tuán)放入錐形瓶中,加入90 mL蒸餾水,磁力攪拌30 min,靜置10 min,測(cè)定pH。用0.1 mol/L的NaOH滴定并攪拌至pH8.6,消耗的NaOH的體積即為總可滴定酸度,每個(gè)樣品至少重復(fù)操作三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR-DGGE、pH、TTA和流變學(xué)特性所得數(shù)據(jù)應(yīng)用EXCEL(2018)、SPSS(19.0中文版)和Quantity One(v4.6.6)進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)和圖譜分析。采用方差分析法進(jìn)行顯著性分析,顯著性差異水平取P<0.05。每個(gè)數(shù)據(jù)設(shè)置三個(gè)平行樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序技術(shù)分析酸面團(tuán)中真菌菌群結(jié)構(gòu)

2.1.1 Alpha多樣性分析 對(duì)16個(gè)酸面團(tuán)樣品的真菌ITS區(qū)測(cè)序,質(zhì)控后獲得平均有效序列75067條,樣品的Taxon Tags平均14510條,樣品中的平均OTU數(shù)目為172個(gè)。酸面團(tuán)的α-多樣性指數(shù)如表2所示?？傮w來看,Alpha多樣性指數(shù)顯示四組酸面團(tuán)樣品的多樣性豐度大小排序?yàn)锳>C>B>D(P<0.05)。四組酸面團(tuán)的原料均有不同,說明酸面團(tuán)的多樣性與原料組成有關(guān)。

表2 酸面團(tuán)中真菌多樣性比較分析Table 2 Comparative analysis on diversity index of fungi in sourdoughs

2.1.2 真菌菌群結(jié)構(gòu)分析 黏豆包酸面團(tuán)的真菌菌群在門和屬水平上的分布如圖1所示。四組中大部分為未檢出和相對(duì)豐度極少的菌門及菌屬[列為其他(others)],這是由于黏豆包是通過傳統(tǒng)自然發(fā)酵方式生產(chǎn)的,多產(chǎn)于家庭或者小作坊,導(dǎo)致黏豆包在生產(chǎn)過程中微生物環(huán)境不可控,因此酸面團(tuán)中會(huì)出現(xiàn)不常見的真菌,這些真菌由于真菌數(shù)據(jù)庫(kù)有局限而未被注釋。在門水平上(圖1a),四組樣品中門水平上的真菌構(gòu)成稍有差別,但均含有子囊菌門。除子囊菌門外,A組含有擔(dān)子菌和接合菌,B和C組均含有擔(dān)子菌;在屬水平上,黏豆包酸面團(tuán)中酵母菌屬較霉菌屬的豐度更高(圖1b)。四組粘豆包酸面團(tuán)的真菌菌群結(jié)構(gòu)有明顯差異。以江米和大米混合為原料的A組的真菌結(jié)構(gòu)最復(fù)雜,真菌種類最豐富,共有9個(gè)屬(微囊藻屬、隱球酵母菌、德巴利氏酵母屬、曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、附球菌屬(Epicoccum)、威克漢姆酵母屬(Wickerhamomyces)、絲孢酵母屬和根霉屬(Rhizopus)),其中微囊藻屬豐度最高;其次是以黏玉米、黃米、大米單獨(dú)為原料的C組,含有5個(gè)屬(漢遜氏酵母屬、微囊藻屬、隱球酵母菌、德巴利氏酵母屬、絲孢酵母屬),漢遜氏酵母屬的豐度最高;B(江米+黏玉米)和D(黃米+黏玉米)兩組中的菌屬多樣性較低,B組中含有隱球酵母菌和德巴利氏酵母屬,而D組僅含漢遜氏酵母屬。由此可知,四組酸面團(tuán)原料組成不同造成酸面團(tuán)中門和屬水平上的真菌菌群結(jié)構(gòu)不同。

圖1 四組樣品在門水平(a)和屬水平(b)的真菌構(gòu)成Fig.1 Fungi community composition of four group of sourdough at the phylum level(a)and genus level(b)

四組樣品的組間差異物種僅在A和B組中存在(圖2)。結(jié)果顯示僅有A組中檢出種水平上的Sporobolomyces_oryzicola,而在B組中并未出現(xiàn);B組樣品中檢出酵母菌科(f_Saccharomycetaceae)、位于綱水平上的接合菌(c_Incertae_sedis_Zygomycota)、接合菌門(p_Zygomycota)、毛霉菌目(o_Mucorales)、毛霉菌科(f_Mucoraceae)、毛霉菌屬(g_Mucor),而在A組中并未檢出以上真菌。說明A和B兩組的組間物種差異明顯,且A組(江米+大米)對(duì)這種差異造成的影響比B組(江米+黏玉米)小。這種差異存在的原因及該差異所造成的影響不同可能與A、B兩組中原料組成不同有關(guān)。

圖2 LEfSe分析圖Fig.2 The analysis of LEfSe

2.2 PCR-DGGE技術(shù)分析酸面團(tuán)中真菌菌群結(jié)構(gòu)

受高通量測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)注釋信息的局限,進(jìn)一步結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析真菌菌群中種水平的結(jié)構(gòu)差異。

2.2.1 DNA的PCR擴(kuò)增 酸面團(tuán)中真菌和特異性酵母菌DNA擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示,16個(gè)樣品的真菌和特異性酵母26S rDNA D1區(qū)域DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的目的條帶都在250 bp左右，樣品的目的條帶清晰，無明顯雜帶且濃度適當(dāng)，因此PCR產(chǎn)物可用于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 酸面團(tuán)樣品中真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物和特異性酵母菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.3 DNA amplification products of fungi and yeast in sourdoughs注：圖譜中M為DNA marker,1～16為樣品編號(hào)。

2.2.2 真菌DGGE結(jié)果分析 由DGGE圖譜(圖4)和條帶BLAST比對(duì)后的結(jié)果(表3)可知,四組中條帶數(shù)目、遷移率和亮度均有不同,說明四組樣品中真菌菌群多樣性存在差異。A組中有4株酵母菌(分別為普魯蘭久浩酵母、膠紅酵母、清酒假絲酵母和誕沫假絲酵母);B組中檢出2株酵母菌(誕沫假絲酵母和季也蒙畢赤酵母);C組檢測(cè)出3株酵母菌(分別為普魯蘭久浩酵母、葡萄汁酵母和釀酒酵母)和1株白地霉;而D組中僅有2株酵母菌:漢遜氏酵母屬和釀酒酵母。由此可見,各組的真菌構(gòu)成有差異,這與制備酸面團(tuán)采用不同原料和比例有關(guān)。四組樣品中的真菌均以酵母菌為優(yōu)勢(shì)菌群。

圖4 酸面團(tuán)中真菌DGGE圖譜Fig.4 DGGE profile of fungi in 16 of sourdough samples注:圖譜下1～16為樣品編號(hào),圖譜中的a～r為不同位置的條帶編號(hào)。

表3 酸面團(tuán)真菌DGGE圖譜中條帶BLAST對(duì)比結(jié)果Table 3 BLAST results of fungi in DGGE bands in sourdoughs

2.2.3 特異性酵母菌DGGE結(jié)果分析 由于真菌DGGE圖譜顯示酵母菌為酸面團(tuán)的優(yōu)勢(shì)真菌,所以采用特異性酵母PCR-DGGE技術(shù)對(duì)酸面團(tuán)中酵母菌的多樣性進(jìn)一步探究。由特異性酵母菌DGGE圖譜(圖5)和條帶BLAST比對(duì)后結(jié)果(表4)顯示,四組樣品中共檢測(cè)到10株酵母菌,漢遜氏德巴利酵母在四組樣品中均作為優(yōu)勢(shì)酵母出現(xiàn)。普魯蘭久浩酵母和瑟氏哈薩克斯坦酵母作為第二優(yōu)勢(shì)酵母在A、B(江米+黏玉米)和C組(黏玉米、黃米和大米)中出現(xiàn)。單孢釀酒酵母、清酒假絲酵母和誕沫假絲酵母僅在A組(江米+大米)中檢出,且檢出率較高,為江米和大米混合發(fā)酵酸面團(tuán)的特有優(yōu)勢(shì)菌屬;除優(yōu)勢(shì)酵母菌外,A組中還檢出了漢遜氏酵母屬。C組和D組(黃米+粘玉米)分別檢出3株和1株酵母菌,較A組檢出的酵母菌數(shù)量少。此外,在C組檢出的釀酒酵母、奇異酵母兩種酵母菌僅存于11號(hào)樣品中,是大米為原料酸面團(tuán)(11號(hào))的特有菌屬。因此,不同原料組成導(dǎo)致酸面團(tuán)中酵母菌多樣性的差異。

圖5 不同比例組成的酸面團(tuán)特異性酵母菌DGGE圖譜Fig.5 DGGE profile of the specificity of yeasts of DNA of different proportion samples注:圖譜下方1～16為樣品編號(hào);圖譜中的a～l為不同位置的條帶編號(hào)。

表4 酸面團(tuán)特異性酵母菌DGGE圖譜中條帶Blast對(duì)比結(jié)果Table 4 Blast result of the specificity of yeasts in DGGE bands in sourdoughs

2.3 黏豆包酸面團(tuán)樣品的流變學(xué)特性及pH、TTA分析

2.3.1 酸面團(tuán)加熱前后的流變學(xué)特性研究 酸面團(tuán)加熱前后的流變學(xué)特性如表5所示。加熱時(shí)酸面團(tuán)原料中蛋白質(zhì)變性,導(dǎo)致了四組酸面團(tuán)加熱后的黏性和彈性數(shù)值較加熱前明顯降低。A和B兩組相比,B組酸面團(tuán)的黏彈性高于A組,這可能是由于兩組原料中除共有的江米外,B組中的黏玉米中支鏈淀粉含量較A組中大米的高,從而增加了酸面團(tuán)的黏性和彈性。B、D兩組相比,原料中均有黏玉米,但D組中黃米中支鏈淀粉含量較江米中的含量高,且黃米所占比例更大導(dǎo)致D組黏性、彈性和復(fù)合黏度均高于B組。因此,酸面團(tuán)的原料組成可影響?zhàn)ざ拱酿ば院蛷椥浴?/p>

表5 四組酸面團(tuán)樣品基本流變特性(掃描頻率f=1.075 Hz)的變化Table 5 Rheological properties of four groups of sourdough samples(f=1.075 Hz)

2.3.2 pH和TTA 酸面團(tuán)的pH和TTA的測(cè)定結(jié)果 如圖7所示:酸面團(tuán)的平均pH處在4.10～4.60之間,而TTA的平均值則在35.80～72.10 mL之間浮動(dòng),說明酸面團(tuán)的酸度較高,這是由于微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸。A組(江米∶大米=10∶8)pH最高,TTA最低,酸度最低,D組(黃米∶黏玉米=3∶1)則與A組相反,酸度最高(P<0.05)。B(江米∶黏玉米=10∶7)和C組酸度低于D組(P<0.05)。四組的與原料組成各不相同,因此黏豆包酸面團(tuán)的酸度與原料組成有關(guān)。

圖6 四組酸面團(tuán)樣品的pH和TTAFig.6 pH value and TTA value of four groups of sourdoughs注:不同小寫字母表示pH的差異顯著P<0.05,不同大寫字母表示TTA的差異顯著P<0.05。

2.3.3 真菌菌群與酸面團(tuán)的流變學(xué)特性、pH及TTA之間的相關(guān)性分析 生酸面團(tuán)的彈性模量、復(fù)合黏度只與擬威爾酵母(Cyberlindnera)有顯著(P<0.05)正相關(guān)性(圖7),擬威爾酵母的發(fā)酵作用能增強(qiáng)酸面團(tuán)的彈性。生酸面團(tuán)的損耗因子與漢遜氏酵母屬呈正相關(guān),即可加強(qiáng)生面團(tuán)的流體性質(zhì);與隱球酵母菌、Naumovozyma呈負(fù)相關(guān),可增強(qiáng)酸面團(tuán)的固體性質(zhì);絲孢酵母屬、畢赤酵母(Pichia)、Guehomyces和Naumovozyma與熟酸面團(tuán)的損耗因子具有顯著正相關(guān)性(P<0.05),即能夠加強(qiáng)熟酸面團(tuán)的流體性質(zhì)。酸面團(tuán)pH與擲孢酵母屬、漢納酵母屬、亞球殼屬、德克酵母菌(Dekkera)、犁頭霉屬(Absidia)、絲畢赤酵母屬(Hyphopichia)、雙足囊菌屬(Dipodascus)、節(jié)擔(dān)菌屬(Wallemia)、枝孢霉屬(Cladosporium)、毛霉菌(Mucor)、根霉屬、附球菌屬、曲霉屬有顯著正相關(guān)性(P<0.05),說明這些菌屬在酸性環(huán)境受抑制。酸面團(tuán)的TTA值與微囊藻屬、隱球酵母菌、青霉屬和絲孢酵母屬等8個(gè)菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)性(P<0.05),說明酸面團(tuán)的總酸度越高,這8個(gè)菌屬的含量越低,酸性環(huán)境可有效抑制它們生長(zhǎng)。

圖7 酸面團(tuán)中真菌的Spearman相關(guān)性分析熱圖Fig.7 Spearman correlation analysis of fungi in sourdough注:G1、G2、G3和G4分別代表生面團(tuán)的黏性模量、彈性模量、復(fù)合黏度和損耗因子(相位角的正切值);H1、H2、H3和H4分別代表熟面團(tuán)的黏性模量、彈性模量、復(fù)合黏度和損耗因子(相位角的正切值);中間熱圖對(duì)應(yīng)的值為Spearman相關(guān)系數(shù)r,介于-1,1之間,r<0為負(fù)相關(guān),r>0為正相關(guān),標(biāo)*表示顯著性檢驗(yàn)P<0.05。

3 討論與結(jié)論

高通量測(cè)序結(jié)果表明四組酸面團(tuán)中的真菌多樣性各有不同,說明酸面團(tuán)的真菌多樣性與原料組成有關(guān),這與Chen等的研究結(jié)果相似[26]。在屬水平上的結(jié)果與真菌及特異性酵母DGGE均顯示不同原料組成在真菌菌群結(jié)構(gòu)上有不同。A組樣品中真菌(或酵母菌)菌群結(jié)構(gòu)最復(fù)雜,其次是C組,B、D兩組物種多樣性最差。這說明黏豆包酸面團(tuán)的原料組成對(duì)酸面團(tuán)中真菌菌群結(jié)構(gòu)有影響。熊順強(qiáng)[27]的研究也表明不同原料影響酸面團(tuán)中酵母菌豐度和真菌菌群結(jié)構(gòu)。總體上,四組樣品中的真菌在門水平上的構(gòu)成與劉建利等[28]的研究結(jié)果一致。真菌DGGE結(jié)果顯示酸面團(tuán)中以酵母菌為優(yōu)勢(shì)真菌。漢遜氏德巴利酵母是酸面團(tuán)的優(yōu)勢(shì)酵母菌,能夠增加發(fā)酵食品的風(fēng)味[29];普魯蘭久浩酵母和瑟氏哈薩克斯坦酵母為次優(yōu)勢(shì)酵母。烏日娜等[6]利用PCR-DGGE技術(shù)研究以玉米為原料酸面團(tuán)中微生物多樣性,發(fā)現(xiàn)普魯蘭久浩酵母是玉米酸面團(tuán)中的優(yōu)勢(shì)真菌,其能夠在極冷天氣下保持高活性,產(chǎn)生乳糖酶[30]。Spanoghe等[31]發(fā)現(xiàn)瑟氏哈薩克斯坦酵母可導(dǎo)致披薩腐敗,因此應(yīng)加強(qiáng)黏豆包生產(chǎn)環(huán)境的管理以減少有害菌的生長(zhǎng)。B、C和D組檢出的酵母菌數(shù)量較A組中的少,是由于A組酸面團(tuán)的原料江米和大米的粗纖維含量遠(yuǎn)低于其他組[32],A組酸面團(tuán)組織較其他組更精細(xì),碳水化合物更易被利用,所以A組酵母菌種類更豐富。釀酒酵母和奇異酵母是以大米為原料的酸面團(tuán)中的特有菌屬,這與對(duì)小米、藜麥、玉米和高粱等的研究結(jié)果相似[33-35],原因是一些菌株更適宜在特定原料的發(fā)酵環(huán)境中生長(zhǎng)從而成為優(yōu)勢(shì)菌株。

原料組成不同也造成酸面團(tuán)的流變學(xué)特性不同,這與黃蓮燕等[36]的研究結(jié)果一致。四組酸面團(tuán)加熱后的黏性和彈性數(shù)值較加熱前明顯降低,酸面團(tuán)蒸煮后的流變學(xué)特性主要受到淀粉糊化影響[37],同時(shí)原料中的麥膠蛋白和麥谷蛋白含量[38]也會(huì)影響酸面團(tuán)的彈性和粘性。此外,微生物的發(fā)酵作用能夠增加酸面團(tuán)的黏性[39]。酸面團(tuán)的pH在4.10～4.60之間,TTA在35.80～72.10之間,這與劉同杰等[40]的研究結(jié)果基本一致。由結(jié)果可推斷原料組成會(huì)影響酸面團(tuán)的pH和TTA,與申瑞玲等[41]和熊順強(qiáng)[27]的研究結(jié)果一致。

通過高通量測(cè)序技術(shù)分析流變學(xué)特性與黏豆包酸面團(tuán)的微生物菌群的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)生面團(tuán)的彈性模量、復(fù)合黏度只與擬威爾酵母呈正相關(guān),可能是由于擬威爾酵母可分泌真菌淀粉酶,該酶能在很大程度上影響酸面團(tuán)的流變學(xué)特性[42],從而導(dǎo)致酸面團(tuán)的黏彈性增大。酸面團(tuán)中的霉菌屬與pH呈正相關(guān),因此推斷酸性環(huán)境能有效抑制霉菌生長(zhǎng)。Suhr等[43]發(fā)現(xiàn)pH較低的酸性環(huán)境會(huì)抑制腐敗真菌的生長(zhǎng)。同時(shí)酸面團(tuán)中的微囊藻屬、隱球酵母屬、青霉屬和絲孢酵母屬等真菌受到酸面團(tuán)中總酸度高的酸性環(huán)境的抑制。微囊藻屬是一種環(huán)境微生物,它作為致病菌在酸度最低的A組中被注釋出來,且豐度最高[44],這進(jìn)一步說明制作環(huán)境的潔凈對(duì)酸面團(tuán)品質(zhì)的重要性。

本研究結(jié)果表明原料組成不同造成了酸面團(tuán)中真菌和特異性酵母菌群結(jié)構(gòu)的差異,江米和大米混合制備酸面團(tuán)的酵母菌多樣性更豐富。黏豆包酸面團(tuán)中以酵母為優(yōu)勢(shì)真菌,漢遜氏德巴利酵母、普魯蘭久浩酵母和瑟氏哈薩克斯坦酵母為優(yōu)勢(shì)酵母。此外,不同原料組成對(duì)酸面團(tuán)流變學(xué)特性有影響,添加玉米或黃米能增加酸面團(tuán)的黏彈性。擬威爾酵母等真菌的生長(zhǎng)可影響加熱前后酸面團(tuán)的流變學(xué)特性。酸面團(tuán)中酸性環(huán)境可抑制霉菌生長(zhǎng)。本文為找到制作黏豆包的最佳原料組成以及找到并利用黏豆包酸面團(tuán)中的優(yōu)勢(shì)菌種開發(fā)直投式發(fā)酵劑提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)。