耐熱黑曲霉3.316產(chǎn)外切葡聚糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張海娟,李 軍,朱鳳妹(河北科技師范學(xué)院食品科技學(xué)院,河北省果品加工工程技術(shù)研究中心,河北秦皇島 066600)

近年來,利用纖維素酶高效分解植物纖維原料產(chǎn)糖生產(chǎn)燃料乙醇已成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[1],但是工業(yè)生產(chǎn)菌株產(chǎn)酶活性不高仍然是目前纖維素酶生產(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用中存在的難題。因此,選育纖維素高產(chǎn)菌株是纖維素資源的生物轉(zhuǎn)化和拓展纖維素酶應(yīng)用范圍的重要環(huán)節(jié)。纖維素酶是將纖維素降解為葡萄糖的酶,由內(nèi)切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶組成。纖維素酶一般由多種水解酶組成,這些水解酶構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的纖維素酶家族[2]。纖維素酶的水解酶一般分為三類:內(nèi)切葡聚糖酶,又稱為 Cx 酶或 CMC 酶,這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū),隨機(jī)地水解β-1,4 糖苷鍵并產(chǎn)生大量帶有非還原末端的小分子纖維;外切葡聚糖酶,也稱為Ci酶,這類酶則是作用于纖維素線狀分子的末端,水解β-1,4 糖苷鍵,每次作用都會(huì)切下一個(gè)纖維二糖分子,所以也被稱為纖維二糖水解酶;纖維二糖酶,也稱為β-葡萄糖苷酶,將纖維二糖水解成葡萄糖[3-4]。

對(duì)于纖維素酶生產(chǎn)菌株的研究,一開始絕大部分集中于纖維素酶系齊全且酶活力較高的木霉如綠色木霉和里氏木霉等菌株上[5],但木霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中存在多種真菌毒素,有毒性嫌疑;另一方面木霉所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶活力很低,致使纖維二糖在反應(yīng)體系中積累而影響酶解效率,因而其應(yīng)用范圍受到限制。而黑曲霉不產(chǎn)生毒素,是公認(rèn)的安全微生物,并且在產(chǎn)纖維素酶的真菌中,黑曲霉所產(chǎn)纖維素酶系中以外切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶的活力較低[6]。我們前期對(duì)黑曲霉3.316產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了較多的研究[7]。黑曲霉3.316產(chǎn)外切葡聚糖苷酶卻并未見報(bào)道。

對(duì)耐熱黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶培養(yǎng)基優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)的研究,不僅為纖維素酶的食品應(yīng)用提供依據(jù),同時(shí)為構(gòu)建高效表達(dá)的外切葡聚糖苷酶的基因工程菌提供了參考,還可以為蛋白質(zhì)工程提供研究的前提,用于研究不同的食品工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用需求,此類研究正在進(jìn)行中[8]。本實(shí)驗(yàn)通過單因素和響應(yīng)面分析對(duì)黑曲霉3.316產(chǎn)外切葡聚糖苷酶發(fā)酵培養(yǎng)基條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定,旨在提高外切葡聚糖苷酶活力,為進(jìn)一步研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Aspergillusniger3.316 中國微生物菌種保藏中心;小麥秸稈 江蘇省連云港市東?？h;硫酸銨 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;微晶纖維素 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;麥芽糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

FJS-4磁力攪拌水浴鍋 金壇市城西富威實(shí)驗(yàn)儀器廠;YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;TDL-4臺(tái)式離心機(jī) 臺(tái)北市萬方潤(rùn)華實(shí)驗(yàn)儀器廠;V-5100可見分光光度計(jì) 武漢高精密科學(xué)儀器有限公司;HZQ-X100恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 種子培養(yǎng)基:FeSO4·4H2O 0.005 g,KCl 0.25 g,MgSO4·7H2O 0.25 g,K2HPO40.5 g,NaNO31.5 g,蔗糖15 g,pH6.5,蒸餾水500 mL,121 ℃滅菌20 min[9]。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:CaCl20.15 g,MgSO40.15 g,K2HPO41.0 g,(NH4)2SO42.0 g,麩皮 15 g,蒸餾水 500 mL,pH5.5,121 ℃滅菌20 min[10]。

1.2.2 酶活力的測(cè)定 酶活的測(cè)定方法參照李永博等[11]的方法:在具塞比色試管中加入1 mL粗酶液(通過基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵制得),再加入1%微晶纖維素檸檬酸緩沖液2 mL,置于50 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h后加入1.5 mL DNS終止反應(yīng),混勻后,沸水浴煮沸5 min,取出,冰浴冷卻至室溫,用去離子水定容至25 mL,在540 nm的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光值。

酶活力的定義:以1 mL粗酶液1 min水解底物產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

計(jì)算公式[12]:

式中:IU:酶活力,U/mL;M:還原糖含量,mg;t:反應(yīng)時(shí)間,min;D:稀釋倍數(shù);Ew:粗酶液體積,mL;0.18:1 μmol葡萄糖的質(zhì)量,mg

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 碳源的篩選 參照馬騰[10]的方法,在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變情況下,改變碳源,分別以麩皮+玉米粉(1∶1),玉米纖維,麩皮+玉米纖維(1∶1),麩皮+葡萄糖(1∶1),玉米芯,麩皮,葡萄糖,小麥秸稈,麩皮+小麥秸稈(1∶1),玉米秸稈粉,麩皮+玉米秸稈粉(1∶1)為碳源,研究濃度在15 g/500 mL下不同的碳源組成發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.2 小麥秸稈濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以10、12.5、15、17.5、20 g/500 mL小麥秸稈濃度為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源濃度,研究不同小麥秸稈濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.3 氮源的篩選 參照馬騰[10]的方法,以酵母浸粉、硫酸銨、蛋白胨、氯化銨、尿素、硫酸銨+尿素(1∶1)、硫酸銨+酵母浸粉(1∶1)、硫酸銨+蛋白胨(1∶1)做為氮源,在其他成分不變的情況下,以不添加氮源為空白組,研究2 g/500 mL濃度下不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.4 氮源濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以1.5、1.75、2、2.25、2.5 g/500 mL硫酸銨濃度為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源濃度,研究不同硫酸銨濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶的影響。

1.2.3.5 誘導(dǎo)物的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉、水楊苷、乳糖、麥芽糖、羧甲基纖維素鈉+麥芽糖(1∶1)、微晶纖維素+羧甲基纖維素鈉(1∶1)、羧甲基纖維素鈉+乳糖(1∶1)、微晶纖維素+麥芽糖(1∶1)、微晶纖維素+乳糖(1∶1)、微晶纖維素+水楊苷(1∶1)為誘導(dǎo)物,研究0.5 g/500 mL濃度下不同的誘導(dǎo)物對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.2.3.6 誘導(dǎo)物濃度的篩選 參照馬騰[10]的方法,分別以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/500 mL微晶纖維素+麥芽糖濃度為發(fā)酵培養(yǎng)基的誘導(dǎo)物濃度,研究不同微晶纖維素+麥芽糖濃度對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基的影響。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取小麥秸稈濃度(A)、硫酸銨濃度(B)、微晶纖維素+麥芽糖濃度(C)為響應(yīng)面的三個(gè)單因素變量,建立以外切葡聚糖苷酶活力(Y)為響應(yīng)值的多元性回歸模型方程。利用Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析[13-14],試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素及其水平Table 1 Levels of variables tested in Box-Benhnken design

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.2.5.1 最適溫度、熱穩(wěn)定性的測(cè)定 將pH5.5的粗酶液1 mL分別在30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中保溫30 min[11]后,測(cè)定外切葡聚糖苷酶的酶活力。

另一組試驗(yàn)將粗酶液在30、40、50、60、70 ℃的水浴鍋中保溫1 h時(shí)間后,測(cè)定其剩余酶活力,研究溫度對(duì)酶熱穩(wěn)定性的影響[15]。

1.2.5.2 最適pH、不同pH穩(wěn)定性的測(cè)定 將1 mL粗酶液在不同pH和溫度50 ℃下反應(yīng)30 min后,測(cè)定其酶活。另一組試驗(yàn)將粗酶液在50 ℃條件下保溫1 h時(shí)間后,測(cè)定其原相對(duì)酶活力,測(cè)定pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響[16]。

1.2.5.3 不同金屬離子對(duì)酶分解纖維素能力的影響 本試驗(yàn)選取幾種常見金屬離子[17],對(duì)照組和樣品組在相同環(huán)境下試驗(yàn),以對(duì)照組為最高酶活(100%),其余為相對(duì)酶活力。以將1 mL粗酶液,分別加入0.5 mL不同金屬離子(KCl、NaCl、MnSO4、MgSO4、FeSO4、CuSO4、對(duì)照)溶液以及0.5 mL去離子水為對(duì)照組,保溫1 h后測(cè)定其相對(duì)酶活。以不添加金屬離子為試驗(yàn)組,保溫1 h后測(cè)定其酶活力。

1.2.5.4 不同濃度的鹽溶液對(duì)酶活力的影響 將1 mL粗酶液和0.5 mL濃度為2、4、6、8、10、12 g/L的NaCl鹽溶液,在水浴鍋中反應(yīng)30 min后,測(cè)定其粗酶活。以NaCl濃度為0 g/L的酶活力為100%。得出不同濃度的鹽溶液相對(duì)酶活力影響。

1.2.5.5 不同濃度的表面活性劑對(duì)酶活力的影響 將1 mL粗酶液和0.5 mL不同表面活性劑吐溫-80的濃度,反應(yīng)30 min后,測(cè)定其粗酶活[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010表格繪圖、SPSS 21軟件、Duncan氏多重比較、Canoco for Windows 4.5、Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析。在但因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Design-Expert 8.0響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和分析數(shù)據(jù)結(jié)果,試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定三次平行去平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源的確定 選取單一物質(zhì)和混合物質(zhì)為碳源,圖1結(jié)果表明小麥秸稈是黑曲霉產(chǎn)外切葡聚糖苷酶最適合的碳源,這可能是由于小麥秸稈作為天然的碳源,其含有較多的礦物成分和纖維素,當(dāng)利用小麥秸稈作為碳源時(shí),其誘導(dǎo)了黑曲霉分泌纖維素酶[18]。通過試驗(yàn)得出小麥秸稈相較于其他實(shí)驗(yàn)碳源表現(xiàn)極顯著(P<0.01)。另外小麥秸稈作為一種普遍、價(jià)廉的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物,也滿足了工業(yè)上對(duì)廉價(jià)碳源的要求。

圖1 不同碳源種類對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on enzyme activity注:不同小寫字母代表不同處理間P<0.01水平下的極顯著性差異；圖2～圖6同。

2.1.2 小麥秸稈濃度的確定 圖2結(jié)果表明,外切葡聚糖苷酶在濃度10～15 g/500 mL時(shí),酶活力先下降后上升,但是在15～20 g/500 mL時(shí),酶活力下降。小麥秸稈中含有豐富的纖維,當(dāng)纖維素達(dá)到一定量時(shí),能夠促進(jìn)微生物生長(zhǎng)加速產(chǎn)酶,但是纖維素含量太高,反而抑制微生物的生長(zhǎng),從而抑制產(chǎn)酶量[19],另外小麥秸稈的添加量太多,會(huì)影響微生物的通氧量,致使微生物不能呼吸而影響產(chǎn)酶結(jié)果。綜上所述，選擇15 g/500 mL為最適濃度并以此為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖2 不同濃度小麥秸稈對(duì)酶活力的影響Fig.2 Effect of different concentrations of wheat straw on enzyme activity

2.1.3 氮源的確定 常見的氮源種類有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源。圖3結(jié)果表明硫酸銨是使得外切葡聚糖苷酶最適合的氮源。通過試驗(yàn)得出硫酸銨相較于其他實(shí)驗(yàn)氮源表現(xiàn)極顯著(P<0.01)。雖然硫酸銨+尿素、硫酸銨作為氮源使得酶活力增大,硫酸銨+尿素使得酶活力達(dá)到13.418 U/mL,但是氮源為硫酸銨時(shí),酶活力達(dá)到14.195 U/mL,所以硫酸銨使得酶活力最大,最終確定選用硫酸銨為最終氮源。

圖3 不同氮源種類對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity

2.1.4 硫酸銨濃度的確定 圖4結(jié)果表明,外切葡聚糖苷酶在1.5～2.25 g/500 mL范圍內(nèi)先增后減,至2.25 g/500 mL濃度達(dá)到最大,2.25～2.5 g/500 mL范圍內(nèi)降低;氮源微生物生長(zhǎng)必不可少的物質(zhì)之一,若硫酸銨含量過多,會(huì)不利于蛋白質(zhì)和氨基酸的合成,對(duì)菌體細(xì)胞物質(zhì)有傷害[20]。綜上所述,2.25 g/500 mL為最適濃度并以此為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖4 不同濃度氮源對(duì)酶活力的影響Fig.4 Effect of nitrogen sources at different concentrations on enzyme activity

2.1.5 誘導(dǎo)物的確定 單一誘導(dǎo)物和混合誘導(dǎo)物能夠影響黑曲霉分泌結(jié)合蛋白,從而影響轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá),激發(fā)特定酶的合成[21]。選用不同的誘導(dǎo)物加入黑曲霉培養(yǎng)基中,觀察黑曲霉培養(yǎng)產(chǎn)纖維素能力,試驗(yàn)結(jié)果見圖5。利用微晶纖維素做誘導(dǎo)物對(duì)黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶影響極顯著(P<0.01),但是利用微晶纖維素+麥芽糖作為誘導(dǎo)物時(shí),黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶顯著升高(P<0.01),達(dá)到12.543 U/mL,確定微晶纖維素+確定麥芽糖作為誘導(dǎo)物。

圖5 不同誘導(dǎo)物對(duì)酶活力的影響Fig.5 Effect of different induced species on enzyme activity

2.1.6 微晶纖維素+麥芽糖濃度的確定 圖6結(jié)果表明,利用微晶纖維素+麥芽糖作為誘導(dǎo)物,黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶在0.5～1 g/500 mL微上升,1～2 g/mL范圍內(nèi)先下降后上升,在2.0～2.5 g/500 mL范圍內(nèi)下降;當(dāng)微晶纖維素+麥芽糖濃度在2 g/500 mL時(shí),黑曲霉分泌外切葡聚糖苷酶活力最高。這可能是由于微晶纖維素+麥芽糖作為誘導(dǎo)物,在低濃度時(shí),降低黑曲霉內(nèi)的結(jié)合蛋白的形成,無法使基因正常表達(dá)。當(dāng)微晶纖維素+麥芽糖濃度較高時(shí),其誘導(dǎo)作用在菌體內(nèi)占主導(dǎo),因此菌體分泌外切葡聚糖苷酶活力較高。綜上所述,2.0 g/500 mL為最適濃度并以此為響應(yīng)面試驗(yàn)中心點(diǎn)。

圖6 不同濃度誘導(dǎo)物對(duì)酶活力的影響Fig.6 Effect of different concentrations of inducers on enzyme activity

2.2 中心組合試驗(yàn)結(jié)果及響應(yīng)面分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，以Y(外切葡聚糖苷酶的酶活力)為響應(yīng)值的情況下,用CCD(Central Composite Design)程序進(jìn)行多元回歸分析,獲得Y(外切葡聚糖苷酶活力)對(duì)A(小麥秸稈濃度)、B(硫酸銨濃度)、C(微晶纖維素+麥芽糖濃度)的三元二次回歸方程:Y=2.11-0.031A-8.875E-003B+0.063C+0.020AB-4.250E-003AC-0.049BC-0.16A2-0.12B2-0.098C2?；貧w模型和方差分析見表3。

表2 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental matrix and results with CCD

表3 中心組合設(shè)計(jì)回歸模型及方差Table 3 CCD regression models and ANOVA

2.3 響應(yīng)因子的水平優(yōu)化

響應(yīng)面圖和等高線圖如圖7所示,通過三者的兩兩交互作用確定出最優(yōu)點(diǎn)[22]。圖中等高線反應(yīng)交互作用的強(qiáng)弱,圓形表示不顯著,橢圓形表示顯著[23]。根據(jù)方差分析結(jié)果及各因素間響應(yīng)面立體分析圖,小麥秸稈濃度(A)、微晶纖維素+麥芽糖濃度(C)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響極顯著(P<0.01),硫酸銨濃度(B)影響顯著(P<0.05);同時(shí),小麥秸稈濃度與硫酸銨濃度交互作用(圖7a)、小麥秸稈濃度與微晶纖維素+麥芽糖濃度交互作用影響不顯著(圖7b);硫酸銨濃度與微晶纖維素濃度+麥芽糖濃度交互作用影響極顯著(圖7c),硫酸銨濃度與微晶纖維素+麥芽糖濃度之間,當(dāng)硫酸銨濃度一定時(shí),外切葡聚糖苷酶的酶活力隨微晶纖維素+麥芽糖濃度的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。

圖7 外切葡聚糖苷酶響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Exoglycosidase response surface map and contour map

根據(jù)含有小麥秸稈濃度14.73 g/500 mL,硫酸銨濃度2.22 g/500 mL,微晶纖維素+麥芽糖濃度2.18 g/500 mL,CaCl20.15 g/500 mL,MgSO40.15 g/500 mL,K2HPO41.0 g/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基,分5組進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。外切葡聚糖苷酶酶活力為2.120 U/mL,與模型預(yù)測(cè)的酶活力2.138U/mL的誤差值<3%。表明該模型能夠很好的預(yù)測(cè)外切葡聚糖苷酶的發(fā)酵情況。

最優(yōu)培養(yǎng)基只影響外切葡聚糖苷酶活力的高低,所以接下來進(jìn)一步研究外切葡聚糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。

2.4 酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 外切葡聚糖苷酶最適溫度的測(cè)定 當(dāng)作用時(shí)間、pH不變時(shí),在不同溫度下,在恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后,得出如圖8。外切葡聚糖苷酶在50 ℃時(shí),酶活最大,50 ℃以后,酶活下降趨勢(shì)明顯,由此說明,溫度對(duì)內(nèi)切葡聚糖苷酶活力影響較大,最適溫度為50 ℃。

圖8 外切葡聚糖苷酶最適溫度Fig.8 Optimum tempera of exoglycosidase

2.4.2 外切葡聚糖苷酶的熱穩(wěn)定性 粗酶溶液在30、40、50、60和70 ℃的水浴中溫浴60 min,并測(cè)定相對(duì)酶活力,以保溫前酶活力為100%[24],得出曲線如圖9所示。由圖9可以看出,對(duì)于外切葡聚糖苷酶來說,當(dāng)溫度從30～50 ℃時(shí),熱穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì),并在50 ℃時(shí)達(dá)到最高,但并未達(dá)到100%,50～70 ℃時(shí),穩(wěn)定性急速下降,酶正在慢慢失活,表現(xiàn)出很差的熱穩(wěn)定性。研究結(jié)果說明外切葡聚糖苷酶適合在較高溫環(huán)境中發(fā)揮作用,并且穩(wěn)定性較強(qiáng)。

圖9 外切葡聚糖苷酶熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of exoglycosidase

2.4.3 外切葡聚糖苷酶最適pH的測(cè)定 通過實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了在pH為1～8下的酶活,得出圖10所示曲線。由圖10可知,外切葡聚糖苷酶pH在1～6時(shí),該曲線是呈上升趨勢(shì)。當(dāng)pH為6時(shí),酶的活性達(dá)到最大值。當(dāng)pH>6,該曲線出現(xiàn)下降趨勢(shì),酶活力逐漸減小。所以,外切葡聚糖苷酶的最適pH為6。

圖10 外切葡聚糖苷酶最適pHFig.10 Optimum pH of exoglycosidase

2.4.4 外切葡聚糖苷酶在不同pH下的穩(wěn)定性 圖11說明對(duì)于外切葡聚糖苷酶來說,當(dāng)pH為1～3期間,穩(wěn)定性呈上升趨勢(shì),較穩(wěn)定;當(dāng)pH為3～4時(shí),穩(wěn)定性逐漸下降,相對(duì)酶活力下降到原酶活的60%左右;當(dāng)pH在4～6時(shí),穩(wěn)定性逐步上升,較穩(wěn)定;pH在6～7期間,穩(wěn)定性逐漸上升;pH在7～8時(shí),穩(wěn)定性逐漸下降。所以外切葡聚糖苷酶屬于在耐酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較強(qiáng)的一種酶。

圖11 不同pH下外切葡聚糖苷酶的穩(wěn)定性Fig.11 Effect of different pH on stability of exoglycosidase

2.4.5 不同金屬離子對(duì)外切葡聚糖苷酶活力的影響 金屬離子會(huì)對(duì)外切葡聚糖苷酶有不同程度的影響[25]。通過與對(duì)照組的對(duì)比,FeSO4、MnSO4、CuSO4等均具有顯著性,但是由外切葡聚糖苷酶中可看出，Mn2+、Fe2+、Cu2+對(duì)該酶的酶活力有激活作用,其中Fe2+的促進(jìn)作用最為明顯,FeSO4極顯著(P<0.01);Mn2+、Cu2+對(duì)該酶的促進(jìn)作用較小,MnSO4、CuSO4較顯著(P<0.05);Mg2+、K+、Na+對(duì)該酶的酶活力表現(xiàn)出抑制作用。

圖12 不同金屬離子對(duì)外切葡聚糖苷酶活力影響Fig.12 Effects of different metal ions on activity of exoglycosidase

2.4.6 不同濃度的NaCl鹽溶液對(duì)外切葡聚糖苷酶活力的影響 由圖13可知,對(duì)于外切葡聚糖苷酶來說,當(dāng)NaCl的鹽溶液中的濃度是2～6 g/L,相對(duì)酶活性正在上升,促進(jìn)了酶的活性。當(dāng)NaCl的鹽溶液中的濃度達(dá)到6 g/L時(shí),相對(duì)酶活力達(dá)到最大值,當(dāng)NaCl的鹽溶液中的濃度為6 g/L后,相對(duì)酶活性呈下降趨勢(shì)。當(dāng)NaCl濃度達(dá)到12 g/L,開始抑制酶活性。

圖13 不同鹽濃度對(duì)外切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.13 Effect of different salt concentration on exoglycosidase activities

2.4.7 不同濃度的表面活性劑對(duì)外切葡聚糖苷酶活力的影響 使用濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的吐溫-80,在同樣環(huán)境、不同質(zhì)量濃度的表面活性劑條件下,以不加表面活性劑處理但其他保存條件相同的粗酶液的酶活做對(duì)照得出,該酶具有較高的表面活性劑耐受性。即設(shè)定吐溫-80濃度為0%的實(shí)驗(yàn)組的酶活力為100%,測(cè)定其他濃度下的相對(duì)酶活[26]。由圖14可知,當(dāng)表面活性劑濃度為0～0.3%時(shí),相對(duì)酶活性增加,并且當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)到0.3%,相對(duì)酶活性達(dá)到最大值為114%;當(dāng)表面活性劑濃度為0.3%～0.4%時(shí),相對(duì)酶活性降低,并且當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)到0.4%時(shí),相對(duì)酶活性達(dá)到最小;當(dāng)表面活性劑是濃度達(dá)到0.4%后,相對(duì)酶活性又開始上升。說明表面活性劑促進(jìn)了外切葡聚糖苷酶的活性。外切葡聚糖苷酶可以將原料的細(xì)胞膜破壞,釋放大量的蛋白質(zhì)等碳水化合物,提高出汁率,纖維素酶將原料降解后產(chǎn)生能提供發(fā)酵作用的葡萄糖,具有應(yīng)用發(fā)酵生產(chǎn)的潛力[27]。

圖14 表面活性劑濃度對(duì)外切葡聚糖苷酶活力的影響Fig.14 Effect of surfactant concentration on activity of exoglycosidase

3 結(jié)論

本研究通過利用單因素和響應(yīng)面法對(duì)黑曲霉3.316產(chǎn)外切葡聚糖苷酶的發(fā)酵培養(yǎng)基條件進(jìn)行優(yōu)化[28],優(yōu)化的培養(yǎng)基使得該菌株產(chǎn)的外切葡聚糖苷酶酶活力強(qiáng),性能優(yōu)良優(yōu)化。耐熱黑曲霉3.316產(chǎn)外切葡聚糖苷酶結(jié)果表明:優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為小麥秸稈14.73 g/500 mL,硫酸銨2.22 g/500 mL,微晶纖維素+麥芽糖2.18 g/500 mL,CaCl20.15 g/500 mL,MgSO40.15 g/500 mL,K2HPO41.0 g/500 mL且對(duì)于酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定:外切葡聚糖苷酶在高溫耐熱環(huán)境中生存,同時(shí)Fe2+有促進(jìn)作用,表面活性劑對(duì)外切葡聚糖苷酶也有促進(jìn)作用,在高效生產(chǎn)燃料乙醇下,外切葡聚糖苷酶在降解過程中發(fā)揮作用。研究試驗(yàn)可能存在當(dāng)酶活力達(dá)到一定時(shí),分解產(chǎn)生的高濃度葡萄糖可能對(duì)產(chǎn)酶量下降。未來可在調(diào)控蛋白基因方面進(jìn)行深度研究[29]。