馬鈴薯不同品種各器官糖苷生物堿累積規(guī)律研究

李玉珠,郭華春,*,王 瓊,*(.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院,云南昆明 65020;2.薯類作物研究所,云南昆明 65020)

糖苷生物堿(Steroidal glycoalkaloids,SGAs)是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物,主要存在于茄科(Solanaceae)和百合科(Liliaceae)植物中[1]。馬鈴薯、番茄、茄子、龍葵、黎蘆等茄科和百合科植物新生芽、花、莖、葉和未成熟的果實中均含糖苷生物堿[2]。糖苷生物堿具有抗微生物、抗蟲和抗真菌等作用,可以幫助植物抵御外界有害物的入侵,且在保持種群間協(xié)同進(jìn)化等方面也具有重要作用[3-4]。而高劑量的糖苷生物堿對動物和人有毒害作用,口服1～5 mg/kg體重就會引起嚴(yán)重中毒反應(yīng),口服3～6 mg/kg體重將會導(dǎo)致死亡[5]。馬鈴薯作為一種糧菜兼用的作物,前人的研究多集中于其毒性及不同品種、不同栽培方式、烹飪方法對塊莖中糖苷生物堿含量的影響方面,目的是減少塊莖中糖苷生物堿含量以降低食用馬鈴薯中毒的風(fēng)險。但同時馬鈴薯糖苷生物堿還具有廣泛的藥理學(xué)活性,如抗菌、抗病毒、抗瘧疾、抗癌、強心、降低膽固醇、預(yù)防鼠傷寒沙門氏菌感染等[6-8]。Friedman等將馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿進(jìn)行提取后用于藥理活性研究,并證實其具有抗癌作用[9]。Kaprang等[10]研究表明α-卡茄堿和α-茄堿能抑制人類肝癌和結(jié)腸癌細(xì)胞生長。其他研究也表明馬鈴薯糖苷生物堿對人皮膚癌、肺癌、肝癌、乳腺癌以及胰腺癌等癌細(xì)胞的生長具有抑制作用[11]。

目前,馬鈴薯糖苷生物堿的測定方法包括高效液相色譜法(HPLC)、液相-質(zhì)譜法(LC-MS)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、生物傳感器法(Biosensor)等。肖文軍等[12]用HPLC法分析馬鈴薯糖苷生物堿的含量,采用的是Wondasil C18柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),但只檢測了α-茄堿。黃紅蘋等[13]也對馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿含量測定進(jìn)行了研究,采用的是 Gmini C18柱(5 μm,250 mm×4.6 mm),也只檢測了α-茄堿的含量。曾凡逵等[14]改進(jìn)了HPLC法可用于準(zhǔn)確并同時測定馬鈴薯中α-卡茄堿和α-茄堿的含量。與高效液相色譜法相比,超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS法)每7 min即可完成一次進(jìn)樣,具有分離效果好、簡便、靈敏、準(zhǔn)確度高、精密性好等特點[15]。

我國是馬鈴薯種植大國,馬鈴薯種植面積居世界第一[16]。我國大部分地區(qū)馬鈴薯收獲時的地上部莖、葉一般都是棄之不用或者焚燒處理[17]造成資源浪費。如能將馬鈴薯莖、葉用于糖苷生物堿提取原材料,可以提高其綜合利用效率,增加經(jīng)濟價值。同時,前人對地上部莖、葉糖苷生物堿累積規(guī)律研究較少。因此,準(zhǔn)確定量馬鈴薯不同器官中糖苷生物堿含量并掌握其含量動態(tài)變化規(guī)律,篩選地上部糖苷生物堿含量高而塊莖含量在安全范圍的品種,對馬鈴薯綜合開發(fā)利用具有重要意義。麗薯6號與青薯9號為云南兩個主栽馬鈴薯品種,滇薯47、滇薯23為云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類作物研究所新登記品種,具有廣泛推廣價值。本文通過檢測四個品種馬鈴薯塊莖、莖、葉中四個生長時期糖苷生物堿含量,得出不同品種馬鈴薯各器官糖苷生物堿累積規(guī)律,為后續(xù)生產(chǎn)實踐中馬鈴薯莖、葉綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬鈴薯 品種為滇薯47、滇薯23、麗薯6號、青薯9號,均來自于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)薯類研究所,采用起壟覆白膜的栽培方式;α-卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品(CAS:20562-03-2)、α-茄堿標(biāo)準(zhǔn)品(CAS:20562-02-1) 純度均≥98%,法國Extrasynthese公司;甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇、乙酸銨 色譜純,美國Sigma公司;0.22 μm有機濾頭 Biosharp公司;乙酸、乙腈 分析純,廣東光華科技股份有限公司。

Thermofisher TSQ FortisTM型超高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(UHPLC-MS/MS) 美國Thermo Fisher Scientific公司;Allegra 64R貝克爾曼臺式高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特商貿(mào)(中國)有限公司;超純水器 北京歷元公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和工作溶液的配制 用色譜純的甲醇將馬鈴薯糖苷生物堿SGAs標(biāo)準(zhǔn)品分別定容成標(biāo)準(zhǔn)儲備液(α-卡茄堿:200 μg/mL;α-茄堿:400 μg/mL)。然后用流動相分別將儲備液配成4 μg/mL的中間液。分別吸取α-卡茄堿、α-茄堿不同體積的標(biāo)準(zhǔn)中間液,用流動相逐級稀釋成質(zhì)量濃度為2、4、10、20、40、80、160、300、400、800 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,后將兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液混合,制成濃度為1、2、4、10、20、40、80、160、300、400 ng/mL混合液進(jìn)樣檢測后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。所有的標(biāo)準(zhǔn)品和工作液存放于-20 ℃的黑暗條件下,而工作液在使用前儲存在4 ℃黑暗條件下。

1.2.2 馬鈴薯樣品制備 馬鈴薯塊莖與莖、葉于現(xiàn)蕾期、盛花期、淀粉積累期、收獲期(成熟)各采樣一次,并測定其糖苷生物堿含量。每個品種隨機采收馬鈴薯6株,將莖、葉、塊莖分離洗凈,每株隨機挑選6個馬鈴薯塊莖,用自來水清洗干凈,在室溫下晾干。參照聶緒恒[18]的方法提取并檢測。根據(jù)馬鈴薯塊莖的解剖學(xué)結(jié)構(gòu),手動將馬鈴薯塊莖表皮(1～2 mm)、皮層(1～2 mm)、髓部分開[19],并將馬鈴薯表皮、皮層、髓部分別剁碎至1 mm×1 mm×1 mm大小,取剁碎后鮮樣1 g左右,加入5%醋酸溶液定容至10 mL,靜置提取12 h,后將所得溶液用高速冷凍離心機在4 ℃,8000 r/min下離心10 min,隨后吸取0.5 mL上清液用80%乙腈溶液稀釋定容至25 mL,手動搖勻,然后用2.5 mL注射器吸取溶液經(jīng)0.22 μm有機濾頭過濾轉(zhuǎn)移至1.5 mL HPLC樣品瓶中進(jìn)UHPLC-MS/MS檢測。

莖、葉樣品60 ℃烘干至恒重,打粉,取干樣0.2 g,加入5%醋酸溶液定容至10 mL,靜置提取12 h,后將所得溶液用高速冷凍離心機在4 ℃,8000 r/min離心10 min,吸取0.5 mL上清液用80%乙腈溶液稀釋定容至25 mL,手動搖勻,再吸取0.5 mL稀釋至5 mL,然后用2.5 mL注射器吸取溶液經(jīng)0.22 μm有機濾頭過濾轉(zhuǎn)移至1.5 mL HPLC樣品瓶中進(jìn)UHPLC-MS/MS檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 液相色譜條件:Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1. 8 μm;填料為雜化硅烷);流動相A為含有5 mmol/L乙酸銨的0.01%甲酸水溶液,流動相B為含有0.01%甲酸的乙腈溶液,A∶B=95∶5 (V/V),流速0.3 mL/min,進(jìn)樣量10 μL,柱溫箱溫度25 ℃。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用ESI源,正離子模式進(jìn)行檢測,噴霧電壓(Pos Ion Spray Voltage)3500 V,鞘氣(Sheath Gas)30 Arb,輔助氣壓(Aux Gas)8 Arb,離子傳輸管溫度(Ion Transfer Tube Temp)350 ℃,氣化溫度(Vaporizer Temp)250 ℃,氮氣作為去溶劑氣和離子吹掃氣,進(jìn)氣量為0.7 MPa,超純氬氣為碰撞氣,進(jìn)氣量為0.1 MPa,碰撞能量為55 V。

1.3.3 線性范圍與定量限 利用UHPLC-MS/MS方法,α-茄堿的線性范圍為1～400 ng/mL,線性方程為Y=969.82X,(X為α-茄堿濃度,Y為峰面積),R2=0.9980;α-卡茄堿的線性范圍為1～400 ng/mL,線性方程為Y=1176.08X,(X為α-卡茄堿濃度,Y為峰面積),R2=0.9970。

塊莖SGAs含量計算公式如下:

總SGAs(mg/100 g·FW)=α-卡茄堿+α-茄堿

式中,A為峰面積;D為稀釋倍數(shù);V為定容體積(mL);m為鮮樣取樣量(g)。

莖、葉SGAs含量計算公式如下:

總SGAs(mg/100 g·FW)=α-卡茄堿+α-茄堿

式中,A為峰面積;D為稀釋倍數(shù);V為定容體積(mL);m1為干樣取樣量(g);m2為烘干后質(zhì)量,m3為烘干前鮮重。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析并制圖,采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果

采用ESI源,正離子模式進(jìn)行檢測,所采用的最終參數(shù)如表1所示,在此條件下所得的馬鈴薯標(biāo)準(zhǔn)品、塊莖、莖、葉的離子流圖如圖1所示。由于α-茄堿和α-卡茄堿含有相同的甾體生物堿結(jié)構(gòu),僅有糖基不同,因此均能找到m/z=398的子離子。

表1 α-卡茄堿和α-茄堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Parameters of MS for α-chaconine and α-solanine

圖1 馬鈴薯樣品糖苷生物堿的總離子流圖及離子對提取圖Fig.1 Total ion chromatogram and ion pair extraction diagram of glycoalkaloids from potato samples注:(a)標(biāo)準(zhǔn)品;(b)滇薯47馬鈴薯塊莖樣品;(c)麗薯6號馬鈴薯莖樣品;(d)青薯9號馬鈴薯葉樣品。

2.2 不同品種馬鈴薯塊莖糖苷生物堿累積規(guī)律

2.2.1 不同品種馬鈴薯塊莖α-卡茄堿累積規(guī)律 從圖2可以看出,不同品種馬鈴薯塊莖中α-卡茄堿含量在四個生長時期均表現(xiàn)為表皮>皮層>髓部,且表皮α-卡茄堿含量始終顯著(P<0.05)高于皮層和髓部。隨著生長進(jìn)程的推進(jìn),塊莖中α-卡茄堿含量呈下降趨勢。收獲期不同品種馬鈴薯表皮、皮層、髓部α-卡茄堿含量在14.13～7.43、3.25～0.58和0.22～0.16 mg/100 g·FW之間,與現(xiàn)蕾期相比分別下降12.74～7.31、5.37～1.00、1.19～0.30 mg/100 g·FW,降幅36.11%～60.17%、50.19%～89.06%、33.84%～84.56%。除滇薯47皮層、髓部以及麗薯6號髓部α-卡茄堿含量在從現(xiàn)蕾期至收獲期無顯著性差異外,其余各部位均在收獲期顯著(P<0.05)降低。收獲期麗薯6號馬鈴薯塊莖表皮、皮層、髓部α-卡茄堿含量顯著高于其他三個品種(P<0.05)。

圖2 不同品種馬鈴薯塊莖α-卡茄堿累積Fig.2 Accumulation of α-chaconine in different cultivars of potato tubers注:不同小寫字母為同一部位不同時期數(shù)據(jù)顯著差異(P<0.05);圖3～圖6同。

圖3 不同品種馬鈴薯塊莖α-茄堿累積Fig.3 Accumulation of α-solanine in different cultivars of potato tubers

2.2.2 不同品種馬鈴薯塊莖α-茄堿累積規(guī)律 不同品種馬鈴薯塊莖α-茄堿含量在四個生長時期均表現(xiàn)為表皮、皮層、髓部,且表皮含量始終顯著高于皮層和髓部。收獲期麗薯6號α-茄堿含量顯著高于其他三個品種(P<0.05),隨著生長進(jìn)程的推進(jìn),馬鈴薯塊莖中的α-茄堿含量呈下降趨勢,與α-卡茄堿累積規(guī)律一致。收獲期不同品種馬鈴薯表皮、皮層、髓部α-茄堿含量在7.95～3.28、2.15～0.29和0.54～0.10 mg/100 g·FW之間,與現(xiàn)蕾期相比分別下降7.32～2.89、3.84～0.55、0.82～0.22 mg/100 g·FW,降幅35.35%～50.20%、29.07%～88.99%、10.80%～87.97%。除滇薯47皮層、髓部,麗薯6號髓部從現(xiàn)蕾期至收獲期α-茄堿含量降低不顯著外,其余均顯著降低(P<0.05)。

圖4 不同品種馬鈴薯塊莖總SGAs累積Fig.4 Accumulation of steroidal glycoalkaloids in different cultivars of potato tubers

2.2.3 不同品種馬鈴薯塊莖總SGAs累積規(guī)律 不同品種馬鈴薯塊莖總SGAs含量在四個生長時期表現(xiàn)為表皮、皮層、髓部,且表皮含量始終顯著(P<0.05)高于皮層和髓部,表明馬鈴薯塊莖糖苷生物堿主要集中在表皮。隨著生長進(jìn)程的推進(jìn),馬鈴薯塊莖中的總SGAs含量呈下降趨勢,與α-卡茄堿、α-茄堿累積規(guī)律一致。收獲期不同品種馬鈴薯表皮、皮層、髓部總SGAs含量含量在22.08～10.70、5.40～0.89和1.12～0.26 mg/100 g·FW之間,與現(xiàn)蕾期相比分別下降20.05～10.62、9.18～1.54、2.01～0.36 mg/100 g·FW,降幅為:61.46%～35.84%、89.08%～42.24%、85.93%～24.38%。除滇薯47皮層、髓部,麗薯6號髓部從現(xiàn)蕾期至收獲期總SGAs含量降低不顯著外,其余均顯著(P<0.05)降低。

四個品種馬鈴薯塊莖收獲期表皮和皮層總SGAs含量均表現(xiàn)為麗薯6號>滇薯47>滇薯23>青薯9號,而髓部總SGAs含量表現(xiàn)為滇薯47>麗薯6號>青薯9號>滇薯23。表明馬鈴薯塊莖總SGAs含量存在品種差異。

2.3 不同品種馬鈴薯莖中糖苷生物堿累積規(guī)律

從圖5中可以看出,四個品種馬鈴薯莖中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量均隨著馬鈴薯成熟逐漸增加,在收獲期莖中糖苷生物堿含量達(dá)最高,與塊莖累積規(guī)律相反。在四個生長時期滇薯47莖中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量始終顯著(P<0.05)高于麗薯6號與滇薯23、青薯9號(P<0.05)。從現(xiàn)蕾期至收獲期滇薯47α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別增加了290.20%、257.85%、278.77%;滇薯23α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別增加了237.09%、399.55%、281.95%;麗薯6號α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別增加了403.44%、361.14%、391.85%;青薯9號α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別增加了321.48%、768.95%、401.69%。

圖5 不同品種馬鈴薯莖SGAs累積Fig.5 SGAs accumulation in potato stems of different cultivars

收獲時滇薯47莖中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別為(284.61±26.20)、(142.64±12.33)、(427.25±38.02) mg/100 g·FW。收獲時滇薯47莖中總SGAs含量是滇薯23的14.02倍,是麗薯6號的2.26倍,是青薯9號的11.05倍。

2.4 不同品種馬鈴薯葉中糖苷生物堿累積規(guī)律

從圖6中可以看出,四個品種馬鈴薯葉中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量均隨著馬鈴薯成熟含量增加,在收獲期葉中糖苷生物堿含量達(dá)最高,與莖中累積規(guī)律一致。在收獲期莖中糖苷生物堿含量達(dá)最高,與塊莖累積規(guī)律相反。在四個生長時期滇薯47莖中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量始終顯著高于麗薯6號與滇薯23、青薯9號(P<0.05)。從現(xiàn)蕾期至收獲期滇薯47葉中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別增加了3608.99%、1434.80%、2961.26%,滇薯23增加了961.79%、302.74%、795.86%;麗薯6號增加了640.07%、302.74%、528.84%;青薯9號增加了1669.37%、948.72%、1482.00%。

圖6 不同品種馬鈴薯葉SGAs累積Fig.6 SGAs accumulation in potato leaves of different cultivars

收獲時滇薯47葉中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別為(218.46±41.15)、(38.37±8.50)、(256.84±49.51) mg/100 g·FW,收獲期滇薯47總SGAs含量是滇薯23的16.96倍,是麗薯6號的2.18倍,是青薯9號的10.82倍。

3 討論

影響馬鈴薯塊莖糖苷生物堿含量的影響因素有很多,其中最主要的影響因素有遺傳與環(huán)境因素、栽培措施、貯藏和加工方法等[20]。其中,品種和基因型對鈴薯糖苷生物堿含量起到?jīng)Q定性作用[21]。在本試驗中,在收獲期時馬鈴薯塊莖總SGAs含量麗薯6號表皮顯著高于其他三個品種(P<0.05),滇薯47與麗薯6號皮層和髓部均顯著高于滇薯23與青薯9號(P<0.05)。有研究表明,彩色馬鈴薯不易積累糖苷生物堿[22],在本研究中也有所體現(xiàn)。滇薯23與青薯9號為紅皮馬鈴薯,塊莖中糖苷生物堿含量較滇薯47、麗薯6號低。本研究還發(fā)現(xiàn)收獲期滇薯47莖、葉總SGAs含量顯著高于其余三個品種(P<0.05)。馬鈴薯糖苷生物堿是通過甲羥戊酸/類異戊二烯通道合成的。類異戊二烯是由3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)催化合成的[23-24]。影響馬鈴薯糖苷生物堿合成的基因主要有HMG1(3-羥基甲基戊二酰輔酶A還原酶),PSS1(鯊烯合酶),SGT1(茄啶半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1),SGT2(茄啶葡糖基轉(zhuǎn)移酶2),SGT3(茄啶鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶3)等[25]。有研究發(fā)現(xiàn),葉和塊莖中糖苷生物堿水平較高的馬鈴薯品種,3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)和角鯊烯合成酶(SQS)基因的表達(dá)量也相應(yīng)較高[23]。本研究中不同品種間糖苷生物堿含量的差異可能是受上述相關(guān)酶含量的調(diào)控,未來需要進(jìn)一步研究確認(rèn)。

美國食品藥品監(jiān)督管理部門(the United States Food and Drug Administration,USFDA)規(guī)定馬鈴薯塊莖中的總糖苷生物堿含量應(yīng)小于20 mg/100 g·FW[26],以保證安全食用。本研究顯示不同品種馬鈴薯收獲時塊莖皮層總SGAs在22.08～10.70 mg/100 g·FW之間,皮層在5.40～0.89 mg/100 g·FW之間,髓部在2.33～0.79 mg/100 g·FW之間。麗薯6號表皮總SGAs為22.08 mg/100 g·FW,略高于此標(biāo)準(zhǔn)。但是在日常飲食中,馬鈴薯及其制品都會進(jìn)行去表皮處理,因此4個品種可食用部分(皮層+髓部)總SGAs含量遠(yuǎn)低于此標(biāo)準(zhǔn),可安全食用。

目前,馬鈴薯糖苷生物堿也被廣泛應(yīng)用與藥理研究。Smith等[27]曾用甲醇提取糖苷生物堿用于研究協(xié)同抑制蝸牛攝食。Friedman等人用馬鈴薯塊莖中提取糖苷生物堿用于抗癌試驗[28]。由于馬鈴薯塊莖中糖苷生物堿含量低,不利于大量提取。本研究發(fā)現(xiàn)收獲期滇薯47莖中α-卡茄堿、α-茄堿、總SGAs含量分別為284.61、142.64和427.25 mg/100 g·FW,葉中分別為218.46、38.37和256.84 mg/100 g·FW,遠(yuǎn)高于塊莖中糖苷生物堿含量,也遠(yuǎn)高于其他三個品種地上部莖、葉糖苷生物堿含量。在理想狀態(tài)下而言,滇薯47莖、葉中總糖苷生物堿提取率可達(dá)到4.2‰和2.6‰。因此,滇薯47號收獲時地下部塊莖可安全食用,同時地上部莖、葉是優(yōu)良的糖苷生物堿提取原料,是提高馬鈴薯植株各部位的綜合利用率的優(yōu)良材料。

4 結(jié)論

本研究選用2個云南省主栽馬鈴薯品種麗薯6號、青薯9號以及具有推廣潛力的2個新育成品種滇薯47、滇薯23為試驗材料,研究了馬鈴薯塊莖、莖和葉不同器官糖苷生物堿累積規(guī)律,結(jié)果表明:馬鈴薯塊莖糖苷生物堿含量隨著塊莖的成熟含量逐漸降低,參試品種收獲時的塊莖糖苷生物堿含量都在可食用安全范圍。而莖、葉中糖苷生物堿含量均隨著生育期的推進(jìn)逐漸增高,在收獲時達(dá)到最高。其中滇薯47收獲期莖、葉總糖苷生物堿含量達(dá)427.25和256.84 mg/100 g·FW,顯著(P<0.05)高于其他三個品種,可作為提取糖苷生物堿進(jìn)行綜合利用的備選品種。