慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠尿液和腎臟的代謝組學(xué)研究

邵曉妮，吳美薇，黑亞南，孫英凱

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610041)

流行病學(xué)研究表明，高尿酸血癥已成為危害工業(yè)化國(guó)家健康的主要問(wèn)題，其患病率在全世界范圍內(nèi)逐年升高[1]。近年來(lái)，有研究通過(guò)縱向觀察和介入研究提出，高尿酸血癥與慢性腎病之間的關(guān)系，并提示血清尿酸水平與腎功能損傷的發(fā)生和發(fā)展具有密切相關(guān)性[2]。組織病理學(xué)研究顯示，79%～99%的高尿酸血癥患者都伴有腎臟損傷[3]。因此，防治高尿酸血癥慢性腎病具有十分重要的意義。

高尿酸血癥誘導(dǎo)慢性腎病的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，且有多種途徑，如激活白細(xì)胞介素( interleukin，IL)-6 ，信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3和活性氧簇[4]。在腎臟中，尿酸能在人腎近端管狀上皮細(xì)胞中誘導(dǎo)單核細(xì)胞趨化蛋白1的產(chǎn)生[5]和激活絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路[6]。尿酸還可激活NOD樣受體蛋白3，并刺激分泌IL-1β和IL-18。而IL-1β和IL-18的激活也是導(dǎo)致腎功能損傷的原因之一[7]。盡管很多致病因素已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但高尿酸血癥誘發(fā)慢性腎病的機(jī)制仍然需要深入研究。

代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之后的一門(mén)新興學(xué)科，主要用于發(fā)現(xiàn)生物體整體代謝變化，揭示機(jī)體生命活動(dòng)的代謝本質(zhì)，通常被用作醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究，包括疾病診斷、生物標(biāo)志物篩查，以及化學(xué)物質(zhì)安全性評(píng)估[8]。

本文利用1H-NMR技術(shù)研究慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠尿液和腎組織中的代謝特征，鑒定其差異代謝物和代謝通路。旨在為高尿酸血癥所致慢性腎病的臨床診斷和治療提供潛在生物標(biāo)志物，并為進(jìn)一步機(jī)制研究奠定堅(jiān)實(shí)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠16只，♂，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京) 2016-0006。飼養(yǎng)溫度(22 ±2) ℃，濕度(55±5)%，噪音<85 dB，提供12 h/12 h白天和黑夜循環(huán)照明，自由飲食飲水。將大鼠分為兩組，對(duì)照組飼喂正常基礎(chǔ)飼料，高尿酸血癥組飼喂2%尿酸和2%氧嗪酸鉀的高尿酸復(fù)合飼料，連續(xù)飼喂12周，本實(shí)驗(yàn)所有動(dòng)物操作均嚴(yán)格按照西南民族大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用規(guī)定。

1.1.2主要試劑 尿酸(uric acid)、氧嗪酸鉀(oxonic acid)(南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司)；血清尿酸(serum uric acid，SUA)、血清葡萄糖(serum glucose，GLU)、血清尿素氮( blood urea nitrogen，BUN) 、血清肌酐(serum creatinine，CREA)血生化試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司)；氘水(D2O)(美國(guó)Sigma公司)。

1.1.3儀器 DP80顯微鏡( 日本Olympus公司)；石蠟組織包埋機(jī)( 德國(guó)Leica公司) ；石蠟組織冷凍機(jī)( 德國(guó)Leica公司) ；病理切片機(jī)( 德國(guó)Leica公司) ；PHY-Ⅲ病理組織漂烘處理儀( 常州中威電子儀器廠) ；高速低溫離心機(jī)( 德國(guó)Heraeus sepatech公司) ；7020全自動(dòng)血生化儀( 日本Hitachi公司) ；Bruker 600 MHz AVANCE Ⅱ NMR ( 德國(guó)Bruker公司)。

1.2 血清生化指標(biāo)水平檢測(cè)10%水合氯醛腹腔注射麻醉慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血，經(jīng)凝固(4 ℃, 60 min)后離心(3 000 r·min-1, 15 min, 4 ℃)得到血清。SUA、GLU、BUN和CREA測(cè)定嚴(yán)格按照血生化試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3 腎臟組織病理學(xué)觀察取大鼠腎臟，固定于4%多聚甲醛中，梯度乙醇脫水，石蠟包埋。將蠟塊切成4 μm厚切片，經(jīng)HE染色，然后用DP80顯微鏡進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)觀察。

1.4 代謝組學(xué)檢測(cè)及分析

1.4.1尿液采集和預(yù)處理 將大鼠尿液樣本收集到含有1%疊氮化鈉容器中低溫放置過(guò)夜。離心(3 500 r·min-1, 15 min, 4 ℃)，除去沉淀，收集上清液。為了盡量減少尿液pH差異所引起的化學(xué)位移變化，將400 μL尿液與200 μL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4) 混合，將混懸液靜置20 min后離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)。然后將500 μL上清液與50 μL D2O(含有0.05%W/VTSP-d4) 加入5 mm NMR管中，振蕩混勻，待測(cè)。

1.4.2腎臟提取和預(yù)處理 大鼠在取樣前應(yīng)禁食過(guò)夜，且所有的樣本均保存在-80 ℃，待分析時(shí)取用。將腎組織樣品稱(chēng)重，冰水浴中用50%氯仿-水溶液勻漿( 5 mL·g-1腎組織) ，離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)。將混懸液靜置冰上30 min。取上清，40 ℃氮?dú)獯蹈伞＜尤?80 μL含有磷酸緩沖液(0.2 mol·L-1Na2HPO4-0.2 mol·L-1NaH2PO4, pH 7.4)和D2O(含有0.05%W/VTSP-d4)中，離心(12 000 r·min-1, 10 min, 4 ℃)，取550 μL上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中，振蕩混勻，待測(cè)[8]。

1.4.31H-NMR測(cè)定 所有尿液和腎組織樣品均在600.13 MHz的核磁共振氫譜下檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)溫度為26.85 ℃，寬度為12 335.5 Hz，采集時(shí)間為2.66 s，弛豫延遲時(shí)間為7.66 s，掃采樣點(diǎn)數(shù)64 K；采集次數(shù)128次。

1.4.41H-NMR圖譜處理及多變量數(shù)據(jù)分析 所有1H-NMR光譜用MestReNova-6.1-6384軟件(西班牙Mestrelab Research公司)對(duì)相位和畸變基線進(jìn)行校正。經(jīng)過(guò)相位的調(diào)整和基線的校正后，尿液的譜圖以加入的TSP-d4( δ 0.00) 為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)譜圖進(jìn)行定標(biāo)，而腎組織中乳酸峰相對(duì)穩(wěn)定，故用乳酸(δ 1.336)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)譜圖進(jìn)行化學(xué)位移校正，將光譜分割為4500段，范圍從δ 0.50～9.50，每個(gè)區(qū)域?qū)挾认嗟? δ 0.002) ，水峰δ 4.70～5.02區(qū)域切除。在樣品識(shí)別分析之前對(duì)集成數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，以消除由組織重量不同而導(dǎo)致的樣品之間的稀釋差異或體積質(zhì)量差異。

將歸一化后生成的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0(Umetrics，Ume，Sweden)中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，首先采用PCA的無(wú)監(jiān)督成分分析方法分析核磁共振光譜數(shù)據(jù)，以分離樣本，隨后采用PLS-DA和OPLS-DA的監(jiān)督成分分析方法更好地進(jìn)行樣本的分離。為了防止過(guò)度擬合，通過(guò)置換分析(200次) 和交叉驗(yàn)證法，對(duì)OPLS-DA模型進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)進(jìn)行模式質(zhì)量評(píng)價(jià)，用R2X、R2Y、Q2等指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，其中R2X表示X的變異百分比，R2Y表示Y的變異百分比，Q2表示累計(jì)預(yù)測(cè)結(jié)果的真實(shí)性。將OPLS-DA模型中所有峰值的變量和變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)的值作為峰值選擇的系數(shù)，并認(rèn)為具有VIP>1的變量與群體分化有關(guān)[9]。此外，采用Tukey’s test (P<0.05) 進(jìn)行分析，僅對(duì)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05的變量的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒別，并根據(jù)P<0.05和VIP>1篩選出差異代謝物。

1.4.5差異代謝物識(shí)別 采用雙參數(shù)法歸屬差異代謝物，參照前期相關(guān)的文獻(xiàn)和代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站( http：//www.hmdb.ca/)，只有同時(shí)滿足相應(yīng)的化學(xué)位移和峰多態(tài)性的化合物，才被認(rèn)為是真實(shí)發(fā)生變化的代謝物。再結(jié)合多變量數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，以VIP>1和P<0.05為篩選條件，最終確定尿液和腎臟中的差異代謝物。

2 結(jié)果

2.1 慢性高尿酸血癥腎病模型大鼠腎臟組織病理學(xué)及血清生化水平檢測(cè)腎臟組織病理學(xué)檢測(cè)顯示，慢性高尿酸血癥大鼠的腎臟已產(chǎn)生病理性萎縮，腎臟表面呈現(xiàn)不規(guī)則凹陷，髓質(zhì)出現(xiàn)淡黃色斑點(diǎn)和放射狀紋路，而皮質(zhì)邊緣變模糊(Fig 1A-D) ，并觀察到腎髓質(zhì)、乳頭和錐體中的尿酸晶體沉積以及腎間質(zhì)的炎癥，且有腎小球硬化、間質(zhì)纖維化、腎小動(dòng)脈硬化(Fig 2A-D)。以上結(jié)果表明，高尿酸血癥可誘發(fā)大鼠慢性腎病。

Fig 1 Kidney typical photos of control and hyperuricaemia ratsA：Typical kidney photo of control rats; B： Kidney longitudinal section photo of control rats; C：Typical kidney photo of hyperuricaemia rats; D： Kidney longitudinal section photo of hyperuricaemia rats.

采用血生化方法測(cè)定慢性高尿酸血癥模型大鼠相關(guān)指標(biāo)水平。正常大鼠SUA為75.8 μmol·L-1，而模型大鼠為258.3 μmol·L-1，相比增加3倍，表明高尿酸血癥大鼠模型構(gòu)建成功(Fig 2E)。對(duì)照組大鼠BUN和CREA水平分別為7.2 mmol·L-1和29.2 μmol·L-1，而模型大鼠分別為9.0 mmol·L-1和42.3 μmol·L-1，表明高尿酸血癥大鼠出現(xiàn)腎功能損傷(Fig 2G, 2H)。高尿酸血癥大鼠血清GLU也增加20%(Fig 2F)。

2.2 尿液和腎組織代謝輪廓分析慢性高尿酸血癥腎病大鼠尿液和腎組織的核磁圖譜見(jiàn)Fig 3。根據(jù)化學(xué)位移、峰形、偶合常數(shù)，并結(jié)合Metabolome數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)圖譜進(jìn)行確認(rèn)，在大鼠尿液中發(fā)現(xiàn)51個(gè)差異代謝物，腎組織中發(fā)現(xiàn)48個(gè)差異代謝物，包含大量參與多種生化過(guò)程的代謝物，如葡萄糖、氨基酸、NAD+和腺嘌呤等。

2.3 多元統(tǒng)計(jì)分析采用PCA散點(diǎn)圖對(duì)所有樣本進(jìn)行分析，以顯示數(shù)據(jù)的原始分類(lèi)狀態(tài)，可以在尿液(R2=0.872, Q2=0.702)和腎臟(R2=0.804,Q2=0.686)的PCA散點(diǎn)圖中均觀察到明顯的分離( Fig 4A, 4D) ，表明模型組大鼠尿液和腎臟中發(fā)生明顯的代謝紊亂。為優(yōu)化兩組分離，本研究采用7倍交叉驗(yàn)證法對(duì)OPLS-DA模型的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證，圖4B ( R2X=0.758, R2Y=0.991, Q2=0.917) 和圖4E (R2X=0.776, R2Y=0.923, Q2=0.765) 分別為尿液和腎臟的OPLS-DA散點(diǎn)圖，同樣觀察到明顯的分離，表明慢性高尿酸血癥腎病大鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝發(fā)生明顯改變。

為進(jìn)一步確定正常組和模型組的主要差異代謝物，從OPLS-DA分析中得到評(píng)分和相關(guān)系數(shù)載荷圖，根據(jù)UV模型的可變權(quán)重對(duì)載荷進(jìn)行著色，如圖( Fig 4C, 4F) 顯示出兩組差異代謝物，根據(jù)兩組之間的化學(xué)位移( VIP>1和P<0.05) ，鑒定出多種差異代謝物( Tab 1,2) 。這些代謝產(chǎn)物均參與糖酵解、三羧酸循環(huán) ( tricarboxylic acid cycle，TCA) 、尿素循環(huán)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝、能量代謝以及抗氧化活性等關(guān)鍵代謝途徑。

Fig 2 Renal histopathology and serum biochemical results of hyperuricaemia and control A： Kidney microscopic image of control rats (×200); B： Kidney microscopic image of hyperuricaemia rats (×200); C： Kidney microscopic image of control rats (×400); D： Kidney microscopic image of hyperuricaemia rats (×400); E： SUA; F： GLU; G： BUN; H： CREA. *P<0.05, **P<0.01 vs control.

Fig 3 600 MHz representative 1H-NMR spectra of urine and renal tissue samples from hyperuricaemia and control ratsA： Urine samples of control rats; B： Urine samples of hyperuricaemia rats; C： Renal tissue samples of control rats; D： Renal tissue samples of hyperuricaemia rats.

Fig 4 Metabolite profiles of urine and renal tissue samples between hyperuricaemia and control ratsA： PCA scores plot, B： OPLS-DA scores plots, C： Color map of the urine samples between hyperuricaemia and control rats; D： PCA scores plot, E： OPLS-DA scores plots, F： Color map of the renal tissue samples between hyperuricaemia and control rats.

Tab 1 Summary of different metabolites between control and hyperuricaemia rats(urine)

Tab 2 Summary of different metabolites between control and hyperuricaemia(renal tissues)

2.4 潛在生物標(biāo)志物的鑒定綜合分析以上結(jié)果顯示，在慢性高尿酸血癥大鼠尿液和腎臟中分別發(fā)現(xiàn)51和48個(gè)潛在差異代謝物，在尿液中，馬尿酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺以及甲基腺嘌呤等代謝物明顯增加；而葡萄糖、γ-氨基丁酸( GABA) 、牛磺酸、精氨酸、蘋(píng)果酸、富馬酸、煙酸鹽、甘露醇和肌醇則明顯減少。在腎臟中，而尿素、天冬氨酸和酪氨酸明顯增加；而葡萄糖、GABA、?；撬帷⒕彼?、甘露醇、NAD+、煙酸、蘋(píng)果酸以及α-酮戊二酸等代謝物則明顯減少。綜合兩組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、?；撬?、精氨酸、甲基腺嘌呤和煙酸在尿液和腎臟中都發(fā)生明顯變化，且主要涉及糖酵解、TCA循環(huán)和氨基酸代謝途徑。這些代謝物可能是慢性高尿酸血癥腎病大鼠的潛在生物標(biāo)志物( Fig 5) 。

3 討論

基于1H-NMR的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)慢性高尿酸血癥大鼠的尿液和腎臟進(jìn)行檢測(cè)，分析其代謝物和代謝通路動(dòng)態(tài)變化情況。造模結(jié)束后，模型組和對(duì)照組的代謝物得到良好分離?？梢?jiàn)，代謝組學(xué)研究可以從慢性高尿酸血癥腎病復(fù)雜的內(nèi)源性代謝物中發(fā)現(xiàn)其變化規(guī)律，也能夠促進(jìn)此方法的臨床應(yīng)用( Fig 6) 。

Fig 5 Fold change of metabolites of urine and renal tissue samples from hyperuricaemia and control rats

3.1 氧化應(yīng)激?；撬崾且环N游離氨基酸，能抵消組織中的氧化活性。據(jù)報(bào)道，為減輕腎損傷患者的氧化活性，會(huì)用升高患者體內(nèi)?；撬岬姆椒ㄟM(jìn)行治療[10]。在慢性高尿酸血癥大鼠的尿液和腎臟中都檢測(cè)出?；撬崦黠@降低，表明?；撬釡p輕氧化活性作用的潛在機(jī)制。因此，牛磺酸可作為高尿酸血癥大鼠氧化活性的生物標(biāo)志物，通過(guò)氧化應(yīng)激過(guò)程，導(dǎo)致腎功能受損。

3.2 能量代謝TCA循環(huán)是機(jī)體ATP產(chǎn)生的主要來(lái)源。慢性高尿酸血癥腎病大鼠的尿液和腎臟中TCA循環(huán)的多個(gè)中間代謝物，包括蘋(píng)果酸、富馬酸、α-酮戊二酸和枸櫞酸等明顯降低。此外，通過(guò)糖酵解降低葡萄糖的利用率可能會(huì)降低丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A的可能性，可見(jiàn)大鼠的TCA循環(huán)總體上受到抑制。

在能量代謝中，谷氨酰胺可以轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸是主要的細(xì)胞能量底物，可進(jìn)入TCA循環(huán)[11]。而在高尿酸血癥大鼠中，谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化和谷氨酸進(jìn)入TCA循環(huán)可能有助于維持TCA循環(huán)的穩(wěn)態(tài)。此外，谷氨酰胺水解也有助于氧化磷酸化過(guò)程中ATP和NAD+的產(chǎn)生。而NAD+作為能量代謝的關(guān)鍵組成部分[12]，在高尿酸血癥大鼠腎臟中明顯降低，可能與腎臟ATP水平降低密切相關(guān)。NAD+是線粒體呼吸、氧化磷酸化、DNA修復(fù)和核信號(hào)傳遞等各項(xiàng)生理過(guò)程所需的重要底物。NAD+的減少與老年人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物氧化損傷的增加以及沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1( silent information regulator 2 homolog1，SIRT1)的活性降低有關(guān)[13]。SIRT1是NAD+依賴(lài)的組蛋白去乙酰化酶，與代謝功能障礙和能量代謝有關(guān)。此外，SIRT1還參與腎損傷的調(diào)節(jié)，包括與衰老相關(guān)的腎損傷、腎組織缺氧、腎間質(zhì)纖維化和腎小管細(xì)胞凋亡[14]。雖然機(jī)制尚不清楚，但研究表明，NAD+的降低及其相關(guān)的SIRT1功能障礙可能與慢性高尿酸血癥腎病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。因此，SIRT1的活化可能成為防治腎損傷發(fā)生和發(fā)展的潛在靶點(diǎn)。

3.3 氨基酸代謝精氨酸是一種半必需氨基酸，內(nèi)源性精氨酸的合成集中在肝臟和腎皮質(zhì)上，腎臟中產(chǎn)生的大多數(shù)精氨酸被釋放到血液中，并分布在全身各處。在腎損傷大鼠中，精氨酸進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)輸受到抑制，而促進(jìn)精氨酸攝取的是陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(cationic amino acid transporter 1，CAT1)。CAT1可轉(zhuǎn)運(yùn)多種陽(yáng)離子氨基酸，這可能競(jìng)爭(zhēng)性抑制精氨酸的攝取。Schwartz等[15]的研究表明，精氨酸在腎損傷大鼠的主動(dòng)脈和腎小球中轉(zhuǎn)運(yùn)降低，并伴隨著CAT1水平降低。雖然其潛在機(jī)制尚未確定，但實(shí)驗(yàn)研究表明，精氨酸的降低可能與慢性高尿酸血癥腎病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

此外，大鼠犬尿氨酸途徑中的代謝物有所升高，而此途徑是由吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)所介導(dǎo)，IDO水平的升高與腎損傷中炎癥和免疫調(diào)節(jié)能力不足有關(guān)。有研究表明，血清中高水平IDO與腎病嚴(yán)重程度和腎損傷有關(guān)[16]。因此，IDO可能是防治慢性高尿酸血癥腎病很有前途的靶點(diǎn)，而未來(lái)研究可集中在IDO的調(diào)控機(jī)制上。