豬肚菇多糖結(jié)構(gòu)表征及其抑制乳腺腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

李婷婷，張秀茹，劉淑文，古麗米然·阿里同別克，吳啟賜，林志超，潘裕添

(閩南師范大學(xué)菌物產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，福建 漳州 363000)

癌癥是致命的全球性疾病，也是影響人口累積生命周期的關(guān)鍵障礙，而針對(duì)于女性健康，屬乳腺癌是影響女性發(fā)病率和死亡率最高的健康問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2012年，全球新診斷乳腺癌病例超過(guò)160萬(wàn)例，乳腺癌死亡人數(shù)達(dá)521 907人[1]，已超過(guò)宮頸癌，嚴(yán)重危害女性健康。雖然包括外科手術(shù)、放射線、激素療法或化學(xué)療法在內(nèi)的積極的治療方法提高了乳腺癌患者的生存率，但副作用強(qiáng)、治愈率低、復(fù)發(fā)快[2]，可用的治療方法還不夠，乳腺癌患者的預(yù)后仍然很差[3]。迄今為止，還尚未發(fā)現(xiàn)有效的乳腺癌醫(yī)治手段。因而研發(fā)有效的抗乳腺癌藥物迫在眉睫。

天然產(chǎn)物是新藥研發(fā)的重要來(lái)源。豬肚菇(Panusgiganteus)，別名“大杯蕈”、“大杯香菇”、“大角菌”等[4]，是近年國(guó)內(nèi)新開(kāi)發(fā)的一種食用藥真菌。目前的資料表明，國(guó)內(nèi)外已有眾多對(duì)于豬肚菇多糖提取的文獻(xiàn)報(bào)道，唐青等[5]以豬肚菇為原料探索其水溶性多糖的最佳提取工藝。Lee等[6]的研究表明從NaCl溶液中提取的豬肚菇粗多糖能延長(zhǎng)S180肉瘤小鼠的生存期。但是，關(guān)于純化的豬肚菇多糖的藥理研究和抗腫瘤活性的報(bào)道很少。

本文選擇豬肚菇為原料，分離純化其多糖組份并進(jìn)行純度分析及結(jié)構(gòu)表征；探究所得的豬肚菇多糖(panusgiganteuspolysaccharide，PGP)對(duì)MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠腫瘤增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，可為豬肚菇的未來(lái)藥物開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)中的小鼠為SPF級(jí)MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因小鼠，小鼠背景為C57BL/6，購(gòu)買(mǎi)自The Jackson Lab(與廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心簽訂科研合作，從其動(dòng)物中心獲取動(dòng)物)。

1.2 藥品與試劑豬肚菇干品，福建成發(fā)食用菌有限公司；DEAE sephadexA-50 葡聚糖凝膠購(gòu)自瑞典Pharmacia公司(貨號(hào)：S9130)；氫氧化鈉(貨號(hào)：687)、乙二醇(貨號(hào)：1)等均購(gòu)自西隴化工股份有限公司；DextranT-10、T-40、T-70、T-500葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Seebio(貨號(hào)：9004-54-0)。山羊抗鼠二抗(貨號(hào)：S0002)、山羊抗兔二抗(貨號(hào)：S0001)均購(gòu)自Affinity公司；β-actin(貨號(hào)：BF0198)、PARP(貨號(hào)：DF7198)、PCNA(貨號(hào)：AF0239)、MMP-9(貨號(hào)：AF5228)、VEGF(貨號(hào)：AF5131)、α-SMA(貨號(hào)：AF1032)抗體均購(gòu)于Affinity公司，IP 裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司(貨號(hào)：P0013C)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自新賽美生物科技有限公司(貨號(hào)：P10300)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器高效液相色譜儀(1200，美國(guó)安捷倫)；紅外光譜掃描儀(iS10,美國(guó)Nicolet)；氣相色譜儀(7890B,美國(guó)安捷倫)；電泳儀 (DYY-7C)；轉(zhuǎn)膜儀 (DYCZ- 40D,北京市六一儀器廠產(chǎn)品)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Omega Lum C,美國(guó)aplegen)；石蠟切片機(jī)(RM2235,徠卡)；倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 豬肚菇多糖的制備取100 g豬肚菇原料干品，在95 ℃下，按1 ∶20的料液比(kg·L-1)加入去離子水浸提3 h，過(guò)濾得濾液和濾渣。濾液離心(12 000 r·min-1，7 min)后經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，Vivaflow 200超濾，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，離心，凍干得豬肚菇粗多糖。將多糖樣品溶液加到DEAE sephadexA-50葡聚糖凝膠層上方。利用0.02 mol·L-1pH 7.2 Tris-HCl溶液洗脫，收集洗脫液，此時(shí)洗脫下來(lái)的即豬肚菇中性糖。將收集的中性糖進(jìn)行超濾、離心、凍干，得PGP。

2.2 HPLC測(cè)定純度和相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取Dextran T-10、T-40、T-70、T-500系列多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)物1 mg，配成2 g·L-1的多糖溶液，0.45 μm過(guò)濾，待上機(jī)。稱取少量PGP，配成約2 g·L-1的溶液，0.45 μm過(guò)濾，待上機(jī)。液相條件：色譜柱7.8 mm×300 mm；柱溫80.0 ℃，流動(dòng)相為超純水，流速0.6 mL·min-1，壓力18.4 bar。

2.3 紅外光譜分析取3～5 mg干燥至恒重的PGP，與干燥的40～50 mg溴化鉀混合，瑪瑙研缽中研磨，均勻混合后壓片，上機(jī)測(cè)量。

2.4 單糖組成分析取120 mg PGP用5 mL的2 mol·L-1硫酸溶液移至安瓿瓶，酒精噴燈封口，水解(100 ℃，8 h)。冷卻后用氫氧化鋇固體調(diào)節(jié)溶液pH 7.00；離心(12 000 r·min-1，15 min)、凍干。將40 mg鹽酸羥胺和2 mL吡啶加入到凍干后的PGP中，在90 ℃水浴鍋中，30 min。室溫冷卻，再加入2 mL乙酸酐，在90 ℃水浴鍋中，30 min。冷卻至室溫，0.45 μm過(guò)濾，待上機(jī)。稱取標(biāo)準(zhǔn)單糖：葡萄糖、木糖、半乳糖、赤蘚醇、甘油、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖各40 mg，按上述進(jìn)行乙?；僮鳌?.45 μm過(guò)濾，待上機(jī)。單糖混標(biāo)：取乙?；钠咸烟?、木糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖各200 μL混合，待上機(jī)。氣相色譜(GC)條件：色譜柱Agilent 19091 J-413 LTM：HP-5，320.00 μm×30.0 m×0.25 μm；柱箱設(shè)定溫度從120 ℃到270 ℃，在270 ℃下保持10 min；色譜柱溫度120 ℃，壓力(11.595 psi)，流量(2 mL·min-1)。

2.5 動(dòng)物模型給藥實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)選取9周齡雌性的 MMTV-PyMT 轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選取初始體質(zhì)量及生長(zhǎng)狀態(tài)相近的小鼠，對(duì)照組與給藥組小鼠各 6 只。稱取PGP 75 mg，加入30 mL生理鹽水，混合均勻后，過(guò)濾，配制成給藥樣品溶液終濃度為 2.5 g·L-1，按照 25 mg·kg-1的劑量尾靜脈注射，給藥周期為 25 d。對(duì)照組采用生理鹽水代替。給藥結(jié)束后，小鼠眼眶取血并脫臼處理，立即解剖小鼠獲取腫瘤組織。將腫瘤組織樣品集中拍照后按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜?，其中一部分用于蛋白水平的檢測(cè)，另一部分加入 4%多聚甲醛固定用于石蠟組織包埋等，實(shí)驗(yàn)中選取同側(cè)同部位的小鼠乳腺實(shí)體瘤組織保證取材的平行性，剩余的樣品存放于-80 ℃超低溫冰箱中。

2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡取瘤組織于1.5 mL離心管中加100 μL裂解液，30 min后，12 000 r·min-1離心15 min，取上清，測(cè)蛋白濃度。調(diào)整樣品濃度，加入5×loading buffer，100 ℃煮樣器中7 min，后4 ℃，12 000 r·min-1離心1 min后上樣，調(diào)整電泳電壓為60 V，150 min，隨后電轉(zhuǎn)，電流300～400 mA，90 min。電轉(zhuǎn)后PVDF膜于5 %脫脂牛奶封閉液中搖1 h，棄去封閉液，加入一抗(濃度由 1 ∶500 到1 ∶2 000，視不同抗體而定)于4 ℃搖床上過(guò)夜?；厥湛贵w，PBST清洗PVDF膜，放入二抗室溫孵育1～1.5 h。ECL試劑盒顯影，使用Omega LumC成像系統(tǒng)顯影，后分析數(shù)據(jù)。

2.7 組織的石蠟包埋與切片制備采用石蠟包埋法包埋腫瘤組織樣本，固定在4%的多聚甲醛中，經(jīng)脫水、透明、浸蠟，于包埋機(jī)中進(jìn)行包埋，而后進(jìn)行切片(厚度 4 μm)、展片，烘片。

2.8 免疫組化及HE染色免疫組化：將切片脫蠟至水洗；經(jīng)微波修復(fù)抗原后，將 3%H2O2滴到組織上，室溫避光 30 min，用PBS洗4 min×5次；加羊血清封閉1 h，同上洗滌；敷一抗，4 ℃過(guò)夜；按照試劑盒的要求敷二抗，同上洗滌，進(jìn)行 DAB 顯色，自來(lái)水洗滌，蘇木精染色，脫水，中性樹(shù)脂封片。

HE染色：同樣方法，將上述切片脫蠟至水洗，蘇木精染色 5 min，自來(lái)水洗滌6 min，置于1%鹽酸乙醇30 s，同上洗滌，伊紅液染色 1～3 min，同上洗滌，脫水，中性樹(shù)脂封片。

3 結(jié)果

3.1 PGP的結(jié)構(gòu)表征利用凝膠色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PGP為單峰組分，表明所提取的豬肚菇中性糖PGP為單組分物質(zhì)(Fig 1A)；建立多糖相對(duì)分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=-4.263 2X+34.206，R2=0.977 8，PGP的保留時(shí)間為8.877 min，代入回歸方程得PGP的相對(duì)分子質(zhì)量為871.331 ku。從紅外光譜掃描結(jié)果分析(Fig 1B)，PGP的官能團(tuán)光譜與β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的基本上一致，在846.22 cm-1處均有吸收峰，該特征峰為葡萄糖β端基差相異構(gòu)C-H變角振動(dòng)吸收峰，由此可推斷PGP為β-糖苷鍵構(gòu)型。

從GC圖譜(Fig 1C)分析可知，PGP的GC柱前衍生化產(chǎn)物與多種標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)比僅出現(xiàn)葡萄糖特征峰，因此，可推斷PGP系由葡萄糖組成的均一多糖。根據(jù)PGP高碘酸氧化和Smith降解后產(chǎn)物的GC圖譜結(jié)果(Fig 1D)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可計(jì)算出PGP每種產(chǎn)物的百分含量，得到甘油、赤蘚醇、甘露糖、葡萄糖占總組分物質(zhì)的量的比例分別為32.55%、54.70%、5.66%和7.09%。從每摩爾己糖殘基中推得，1-6鍵占比30.29%，1-2鍵占比2.25%，1-4鍵占比54.70%，1-3鍵占比12.75%。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出本研究所提取的PGP是由1-2鍵，1-3鍵，1-4鍵，1-6鍵構(gòu)成的高純度的β-葡聚糖。

3.2 PGP對(duì)MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響以MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠動(dòng)物模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，在前期劑量有效性和安全性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，選擇適宜劑量25 mg·kg-1PGP進(jìn)行尾靜脈注射，對(duì)照組尾靜脈注射生理鹽水。給藥25 d后，處死小鼠，取出乳腺腫瘤組織觀察并稱體質(zhì)量。發(fā)現(xiàn)給藥組的瘤重低于模型組的瘤重(如Fig 2B、C)(P<0.01)。綜上，說(shuō)明PGP能明顯抑制乳腺癌的生長(zhǎng)。該結(jié)果為PGP抗乳腺癌作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

Fig 1 Structure analysis of Panus giganteus polysaccharideA： High performance liquid chromatography of Panus giganteus polysaccharide; B：Infrared spectrum of Panus giganteus polysaccharide; C： Monosaccharide gas chromatogram of Panus giganteus polysaccharide; D： GC analysis of Smith degradation products of Panus giganteus polysaccharide

Fig 2 Tumor growth inhibited by PGP in mice with breast cancerA： Breast cancer mice in administration group and control group; B： Comparison of tumor tissue size between the administration group and the control group;C： Statistical results of tumor weight in vs vehicle.

3.3 PGP對(duì)MMTV-PyMT乳腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖及凋亡的影響對(duì)腫瘤組織進(jìn)行切片病理分析和相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測(cè)。從Fig 3A可以看出，模型組HE染色和增殖性細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化明顯均比PGP組密集、顏色加深，說(shuō)明PGP明顯抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖；PGP組可見(jiàn)TUNEL染色綠色熒光強(qiáng)度明顯比模型組增強(qiáng)，表明PGP具有促進(jìn)乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡作用。Western blot 檢測(cè)(Fig 3B)也發(fā)現(xiàn)，PGP下調(diào)PCNA的表達(dá)，同時(shí)還下調(diào)聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(PARP)的表達(dá)(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果從蛋白表達(dá)水平提示，PGP可抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡。

3.4 PGP對(duì)MMTV-PyMT轉(zhuǎn)基因乳腺癌小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響為進(jìn)一步探究PGP是否對(duì)乳腺癌小鼠的腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移存在影響。通過(guò)HE染色檢測(cè)，結(jié)果顯示，PGP給藥組能明顯的減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目(Fig 4B)，表觀上說(shuō)明PGP能抑制小鼠的乳腺腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。采用免疫組化來(lái)檢測(cè)肺組織中α-SMA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PGP能明顯的抑制α-SMA的表達(dá)(Fig 4A)；同時(shí)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PGP給藥后，明顯下調(diào)MMP-9、VEGF及α-SMA等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)(P<0.01)(Fig 4C)。綜上，提示PGP可通過(guò)調(diào)控MMP-9、VEGF及α-SMA表達(dá)從而抑制乳腺癌小鼠腫瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。

Fig 4 Lung metastasis inhibited by PGP in mice with breast cancerA：Immunohistochemical staining results of lung tissue samples of mice with breast cancer,and the brown markwas α-SMA level. The scale corresponding to the group drawing was 50 μm;B：Statistical chart of the number of metastases;C： Western blot results and gray value statistical vs vehicle.

Fig 3 Tumor cell proliferation inhibited and apoptosis promoted by PGP in mice with breast cancerA： HE staining, immunohistochemistry and TUNEL staining to detect the proliferation and apoptosis of breast cancer in mice;B：Western blot vs control.

4 討論

多糖是一類非特異性免疫增強(qiáng)劑，它具有復(fù)雜多樣的生物活性，對(duì)腫瘤、心血管疾病等有一定療效[7]。且科學(xué)研究表明，食用真菌多糖對(duì)于調(diào)節(jié)免疫功能，治療癌癥，延緩衰老和緩解疲勞等方面起著重要的作用。研究結(jié)果表明，多糖的抗腫瘤效果與其結(jié)構(gòu)存在關(guān)系，且認(rèn)為多糖起活性效果或者是抗腫瘤效果的主要是1-3和1-6糖苷鍵[8-9]，云芝多糖以β -(1-4)、β -(1-6)糖苷鍵為主鏈，對(duì)吉田氏肉瘤細(xì)胞、AH -130 細(xì)胞和艾利氏腹水癌細(xì)胞等有明顯的抑制效果[10]。本研究通過(guò)HPLC、紅外以及氣相光譜分析得到PGP具有1-2，1-3，1-4，1-6糖苷鍵，且是以1-4，1-6糖苷鍵為主，經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)研究表明，PGP能有效的抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制肺轉(zhuǎn)移，表明豬肚菇多糖與其他真菌多糖一樣具有抗腫瘤功效，且是一種未見(jiàn)報(bào)道的新型結(jié)構(gòu)豬肚菇β-葡聚糖。

大多數(shù)癌癥的發(fā)生是由于其本身體細(xì)胞的癌癥特異性DNA突變積累引起的(乳腺癌也不例外)，而引起基因突變的因素多種多樣，其中就包括DNA修復(fù)機(jī)制的失活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞不受控制的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。PARP，PCNA作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，在DNA的損傷修復(fù)、DNA復(fù)制、細(xì)胞擴(kuò)散控制方面發(fā)揮著重要作用。早在2017年有報(bào)道，某些藥物可以靶向同源重組DNA修復(fù)功能缺陷，如PARP抑制劑可以靶向治療遺傳性BRCA1和BRCA2乳腺癌。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGP給藥組明顯下調(diào)PCNA的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)PARP蛋白的表達(dá)，提示PGP抑制乳腺腫瘤增殖的機(jī)制可能和DNA修復(fù)機(jī)制有關(guān)。

另外，乳腺癌癥患者臨床預(yù)后往往表現(xiàn)不佳，而腫瘤轉(zhuǎn)移就是其中一個(gè)重要的因素。目前有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的許多成分，致使惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成[11]，而VEGF在腫瘤新生血管生長(zhǎng)中起到重要的作用[12]。其能誘導(dǎo)基質(zhì)降解過(guò)程的許多種酶和蛋白，包括基質(zhì)降解金屬蛋白酶，通過(guò)激活這些不同的復(fù)合物可降解周圍環(huán)境從而利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移和萌芽[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，PGP能明顯抑制MMP-9、VEGF等腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，表明PGP能夠抑制肺轉(zhuǎn)移可能與血管生成存在關(guān)聯(lián)。并且目前研究資料表明，α-SMA表達(dá)增高的癌細(xì)胞具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征，侵襲能力增強(qiáng)[14]。而本研究中，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PGP能明顯的抑制α-SMA的表達(dá)，進(jìn)一步提示PGP可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制肺轉(zhuǎn)移。

綜上，PGP能夠有效的抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡和抑制轉(zhuǎn)移，并從分子水平揭示PGP具有調(diào)控多種相關(guān)蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)抗癌作用，但乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、影響的復(fù)雜過(guò)程，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究與探索。