大黃素甲醚對(duì)酒精性肝損傷中SIRT1-AMPK通路的影響

王瑞婕，楊 勇，白 婷

(大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

在我國(guó)，酒文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，隨著我國(guó)飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)的發(fā)病率迅速增加，其引起的健康問題嚴(yán)重威脅我國(guó)人民的身體健康和社會(huì)發(fā)展[1]。ALD是指長(zhǎng)時(shí)間乙醇作用導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和永久性結(jié)構(gòu)破壞的肝病嚴(yán)重形式，包括輕癥酒精性肝病(mild alcoholic injury)、酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver)、酒精性肝炎(alcohol hepatitis)、酒精性肝纖維化(alcoholic hepatic fibrosis)和酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis)等5種類型[2]。酒精性脂肪肝是指由于長(zhǎng)期大量的酒精攝入導(dǎo)致的肝臟脂肪代謝異常的疾病。酒精進(jìn)入機(jī)體，大部分會(huì)在肝臟被代謝，由于人體代謝能力有限，最終會(huì)引起肝內(nèi)的脂肪堆積，脂肪變性、壞死，從而導(dǎo)致脂肪肝。

沉默信息調(diào)節(jié)因子蛋白1(silent information regulator factor 2 related enzyme 1，SIRT1)，是NAD+依賴的Ⅲ型組蛋白脫乙酰酶，主要通過對(duì)組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子及其它蛋白修飾的賴氨酸殘基進(jìn)行去乙酰化，調(diào)節(jié)基因、蛋白的表達(dá)[3]。酒精的攝入可通過脂聯(lián)素、乙醛、乙酸脂多糖、氧化應(yīng)激等多種方式抑制SIRT1的活性及表達(dá)，進(jìn)而多種轉(zhuǎn)錄因子的活性被抑制或被激活，誘發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)脂肪合成以及脂肪酸氧化過程，因此形成酒精性脂肪肝[4]。伴隨酒精攝入量的不斷增加，呈現(xiàn)漸進(jìn)性發(fā)展趨勢(shì)，可發(fā)展至酒精性肝炎、酒精性肝纖維化、酒精性肝硬化甚至肝癌[5]。Yang等[6]發(fā)現(xiàn)，在C57BL/J小鼠肝臟和HepG2細(xì)胞中，α-硫辛酸可以增強(qiáng)SIRT1去乙酰化酶的活性，通過去乙酰化肝臟激酶1(LKB1)，激活SIRT1/LKB1/腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)信號(hào)通路，發(fā)揮調(diào)節(jié)代謝的作用。LKB1通過磷酸化AMPKα亞基(Thr172)并抑制磷酸化酶對(duì)AMPK的去磷酸化作用從而使其激活[7]。AMPK是能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因其活性受AMP/ATP比值調(diào)控，被稱作細(xì)胞的“能量監(jiān)測(cè)器”，在維持機(jī)體能量代謝平衡、葡萄糖及脂肪酸代謝、細(xì)胞代謝等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]。當(dāng)胞內(nèi)AMP與ATP的比值增加時(shí)，AMPK的磷酸化使下游靶分子激活，一方面糖原、脂肪和膽固醇的合成被抑制，即減少了ATP的利用，另一方面細(xì)胞的分解代謝增加，促進(jìn)脂肪酸氧化、糖酵解，即增加了ATP的產(chǎn)生；當(dāng)AMP與ATP的比值減少時(shí)，細(xì)胞的合成代謝增加，則AMPK的活性受到抑制[9]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c)是調(diào)節(jié)脂肪合成的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，屬于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白家族成員中的一員。在研究酒精性脂肪肝時(shí)發(fā)現(xiàn)，SREBP-1c是AMPK的一個(gè)直接靶蛋白，AMPK抑制SREBP-1c活性是通過磷酸化SREBP-1c的372絲氨酸位點(diǎn)，調(diào)節(jié)蛋白裂解成熟和核內(nèi)轉(zhuǎn)位過程，進(jìn)而抑制固醇調(diào)節(jié)元件依賴的促脂靶蛋白脂肪酸合成酶的表達(dá)[10]。在酒精性肝炎的研究中，基于肝臟巨噬細(xì)胞和肝細(xì)胞的交叉對(duì)話，調(diào)控SIRT1-LKB1-AMPK-SREBP1c通路可抑制脂肪生成和肝臟脂質(zhì)沉積，從而緩解酒精性肝病的進(jìn)程[11]。

大黃素甲醚(physcion，PHY)屬蒽醌類化合物，又名朱砂蓮乙素、非斯酮，是分布最廣泛的一種蒽醌類物質(zhì)，主要從中草藥蓼科植物大黃中提取得到。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素甲醚具有抗炎性因子、抗氧化、抗癌、抗菌以及抗白血病等多種藥理活性[12]。此外，大黃素甲醚對(duì)膽汁淤積肝損傷有一定的保護(hù)作用[13]。因此，本研究擬針對(duì)大黃素甲醚，探討其對(duì)酒精性肝損傷中SIRT1-AMPK通路的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8～10周齡C57BL/6小鼠，健康♂，體質(zhì)量約(20±2)g，由大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(遼)2004-0017。

1.2 藥物與試劑大黃素甲醚(純度>99%，北京索萊寶科技有限公司)；SRT1720(SIRT1激動(dòng)劑)、AICAR(AMPK激動(dòng)劑)(純度>99%，MCE公司)；Lieber-DeCarli酒精液體飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒、甘油三酯(triglyceride，TG)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SIRT1抗體、AMPKα抗體、p-AMPKα抗體、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology公司)；SREBP-1c抗體(Abcam公司)；IL-1β ELISA試劑盒(美國(guó)PeproTech公司)。

1.3 儀器高速冷凍離心機(jī)、Multiskan FC酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)；蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國(guó)Bio Rad公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組將36只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為6組，即正常對(duì)照組(Control)、酒精飼料組(EtOH)、酒精飼料+SRT1720組、酒精飼料+AICAR組、酒精飼料+大黃素甲醚組(PHY 20、40 mg·kg-1)，每組6只。

2.2 模型構(gòu)建采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院酒精濫用與酒精中毒研究所(National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism，NIAAA)肝病研究室建立ALD模型的方法建立小鼠酒精性肝損傷模型[12]。首先給予6組小鼠5 d對(duì)照飲食，作為液體飲食的適應(yīng)期，隨后正式開始實(shí)驗(yàn)：正常對(duì)照組繼續(xù)給予對(duì)照液體飲食；其余5組改為含5%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)，共喂養(yǎng)10 d，每天上午7～9點(diǎn)之間更換飲食。正常對(duì)照組根據(jù)小鼠體質(zhì)量灌胃給予生理鹽水。酒精飼料+SRT1720組灌胃給予50 mg·kg-1SRT1720，酒精飼料+AICAR組灌胃給予500 mg·kg-1AICAR，酒精飼料+大黃素甲醚組分別灌胃給予20、40 mg·kg-1大黃素甲醚，連續(xù)10 d。d 11除對(duì)照組外，其余5組各酒精灌胃(5 g·kg-1體質(zhì)量)1次，對(duì)照組給予等熱量麥芽糖糊精灌胃1次。9 h后處死小鼠，收集血清，分離肝臟，肝臟左葉用10%中性福爾馬林浸泡用于病理檢測(cè)，其余部分放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于后期Western blot蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。

2.3 肝臟外觀形態(tài)觀察及肝指數(shù)測(cè)定小鼠稱體質(zhì)量后眼球取血，頸椎脫臼處死，剖取肝臟，將肝組織置于6 cm培養(yǎng)皿中，用高倍相機(jī)在同視野下拍照觀察外觀形態(tài)。生理鹽水洗血，濾紙吸干后稱肝質(zhì)量。肝指數(shù)/%=肝臟質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%。

2.4 血清生化指標(biāo)檢測(cè)使用ALT、AST、TG檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中三者含量。

2.5 肝組織病理觀察取出在10%中性福爾馬林緩沖液中固定的肝組織，包埋在石蠟中。用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將肝臟包埋塊切成5 μm厚度，常規(guī)HE染色。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察分析肝組織病理學(xué)改變。

2.6 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)免疫組化染色，用石蠟包埋肝組織，切片脫蠟至水，抗原修復(fù)，內(nèi)源性過氧化物酶封閉后一抗4 ℃孵育過夜，增強(qiáng)劑孵育后二抗室溫孵育20 min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察SIRT1、p-AMPKα表達(dá)情況。

2.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1β含量取肝臟標(biāo)本，按照ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測(cè)定肝臟中IL-1β的含量。

2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平從-80 ℃冰箱中取出肝臟組織稱質(zhì)量后，利用液氮和研缽將其粉碎成細(xì)粉。加入組織裂解液進(jìn)一步勻漿研磨，冰上放置充分裂解，30 min后，4 ℃，1 000 r·min-1離心15 min，上清即為肝臟總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，95 ℃熱浴5 min使蛋白變性。采用10% SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，濕法轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶室溫封閉1 h后，加入封閉液稀釋的AMPKα(兔抗，1 ∶1 000)、p-AMPKα(兔抗，1 ∶500)、SIRT1(鼠抗，1 ∶1 000)、SREBP1c(兔抗，1 ∶5 000)抗體和內(nèi)參GAPDH(兔抗，1 ∶1 000)抗體，4 ℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗膜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h后，ECL顯色，暗室中用X膠片感光、顯影、定影、掃描圖片。

3 結(jié)果

3.1 大黃素甲醚對(duì)酒精誘導(dǎo)小鼠狀態(tài)與肝指數(shù)的影響Lieber-DeCarli液體酒精飼料慢性喂養(yǎng)10 d，酒精模型組小鼠出現(xiàn)活動(dòng)量減少，小鼠體質(zhì)量減輕，正常對(duì)照組小鼠毛色光滑，活動(dòng)積極。PHY、SRT1720、AICAR各組小鼠毛色略有改善，活動(dòng)量與精神狀態(tài)也略有改善。肝指數(shù)在一定程度上反映肝臟腫脹情況，大黃素甲醚各組肝指數(shù)雖有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見Fig 1。

Fig 1 Ratios of liver to body

3.2 大黃素甲醚對(duì)血清中ALT、AST、TG含量的影響與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠血清中ALT、AST、TG含量明顯高于正常組(P<0.01)，與酒精模型組相比，大黃素甲醚PHY以及SRT1720、AICAR激動(dòng)劑組小鼠血清ALT、AST、TG明顯降低(P<0.01)，且大黃素甲醚高劑量組要低于各激動(dòng)劑組，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of serum ALT，AST，TG content

3.3 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝組織病理變化的影響如Fig 2所示，大體觀察肝臟表面顏色和光滑度，正常組小鼠肝臟表面光滑，顏色呈紅褐色，酒精模型組小鼠肝臟表面粗糙，色澤較正常組小鼠暗淡。HE染色觀察肝內(nèi)結(jié)構(gòu)，炎癥水腫等病理?yè)p傷，正常組小鼠肝臟未見明顯病變，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)無脂滴形成，肝細(xì)胞無脂肪變性。酒精模型組小鼠肝臟不同程度的水腫，脂質(zhì)內(nèi)分布有許多脂肪空泡，有點(diǎn)狀、片狀壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。大黃素甲醚組以及SRT1720、AICAR激動(dòng)劑組小鼠肝臟腫脹程度明顯減輕，肝組織變性程度也明顯減輕，說明大黃素甲醚在一定程度上減輕肝細(xì)胞的脂肪變性與炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.4 大黃素甲醚對(duì)肝臟組織中IL-1β的影響為了觀察大黃素甲醚對(duì)酒精性肝損傷小鼠肝臟炎癥的影響，采用ELISA測(cè)定肝臟IL-1β水平。與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠肝臟中IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，與模型組相比，SRT1720及AICAR組IL-1β表達(dá)明顯降低，大黃素甲醚高低劑量給藥組明顯降低IL-1β水平(P<0.01)，且存在劑量依賴性，見Fig 3。

Fig 2 Pictures and pathological changes of mouse liver(HE×200)A: Control; B: EtOH; C: SRT1720; D: AICAR; E: PHY (20 mg·kg-1); F: PHY (40 mg·kg-1)

Fig 3 Effect of PHY on IL-1β in mice with##P<0.01 vs control; **P<0.01 vs EtOH.

3.5 大黃素甲醚對(duì)小鼠肝臟中SIRT1、p-AMPKα表達(dá)的影響免疫組化染色測(cè)定PHY及各激動(dòng)劑對(duì)小鼠肝臟中SIRT1、p-AMPKα表達(dá)的影響，采集高倍視野圖像，F(xiàn)ig 4結(jié)果顯示，SIRT1、p-AMPKα細(xì)胞染色呈黃色或棕黃色為陽(yáng)性，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組小鼠肝臟SIRT1、p-AMPKα蛋白表達(dá)明顯減少；與酒精模型組相比，SRT1720及AICAR組SIRT1、p-AMPKα表達(dá)明顯增強(qiáng)，大黃素甲醚組SIRT1、p-AMPKα表達(dá)呈劑量依賴性升高。

3.6 大黃素甲醚對(duì)肝臟組織中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、SREBP1c蛋白水平的影響從Fig 5結(jié)果可知，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組SIRT1表達(dá)以及AMPKα的磷酸化水平受抑制。與酒精模型組相比，SRT1720及AICAR組SIRT1表達(dá)及AMPKα的磷酸化水平明顯升高，大黃素甲醚高低劑量給藥組SIRT1表達(dá)及AMPKα的磷酸化水平明顯增加，且存在劑量依賴性(P<0.01)。此外，與正常對(duì)照組相比，酒精模型組SREBP1c蛋白表達(dá)增加，與酒精模型組相比，PHY高低劑量給藥組以及SRT1720、AICAR組均明顯地降低了SREBP1c蛋白表達(dá)(P<0.01)。

Fig 5 Expression of SIRT1，AMPKα，p-AMPKα，SREBP1c in liver tissues of mice##P<0.01 vs control; *P<0.05，**P<0.01 vs EtOH.

Fig 4 Expression of SIRT1 and p-AMPKα in liver tissues of mice in each group(×200)A: Control; B: EtOH; C: SRT1720; D: AICAR; E: PHY (20 mg·kg-1); F: PHY (40 mg·kg-1)

4 討論

過度飲酒會(huì)導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生，它是ALD的最早期階段，20%～40%的重度飲酒者會(huì)發(fā)展為更嚴(yán)重的ALD，包括酒精性肝炎和肝硬化。許多酒精性肝炎患者都有長(zhǎng)期慢性飲酒史，最近伴有酗酒、醉酒的病史[14]，同樣，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型也發(fā)生上述變化。NIAAA模型(Gao-Binge模型)與人類的飲酒方式高度接近，可模擬人酒精性肝炎的發(fā)病過程，表現(xiàn)為肝臟有較嚴(yán)重的脂肪變性和炎癥，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血清中酒精濃度較高，ALT水平明顯升高[15]。因此，本研究采用含酒精的Lieber-DeCarli飲食喂養(yǎng)小鼠10 d，然后用單劑酒精灌胃1次建立酒精性肝損傷模型。本研究顯示，小鼠模型組的肝臟內(nèi)脂滴沉積，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說明Lieber-DeCarli慢性喂養(yǎng)加急性酒精灌胃成功建立小鼠酒精性肝損傷，且PHY給藥組的小鼠肝臟內(nèi)脂肪沉積隨濃度增加而有所改善。有研究表明大黃甲醚能夠抑制肝臟巨噬細(xì)胞促分裂原激活蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子κB激活，從而發(fā)揮抗炎的作用[16]。為了觀察PHY對(duì)肝細(xì)胞炎癥損傷的影響，采用ELISA測(cè)定IL-1β水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PHY能夠抑制酒精誘導(dǎo)的IL-1β水平，同時(shí)，SIRT1激動(dòng)劑以及AMPK激動(dòng)劑均能降低IL-1β水平，說明PHY能夠抑制酒精性肝損傷的炎癥反應(yīng)。

肝臟是SIRT1主要表達(dá)的器官之一，SIRT1可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、參與糖脂代謝、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)等許多病理生理過程。為了進(jìn)一步探討PHY緩解酒精性肝損傷的機(jī)制，我們研究了其對(duì)SIRT1-AMPK通路的作用。酒精性肝損傷可以降低SIRT1的表達(dá)，肝內(nèi)過表達(dá)SIRT1可防止由ALD引起的肝臟脂質(zhì)代謝損傷[17]。本研究結(jié)果顯示，在酒精性肝損傷小鼠中，肝臟SIRT1表達(dá)量下降，而給予PHY后，SIRT1表達(dá)量明顯升高，且給予SIRT1激動(dòng)劑SRT1720組其表達(dá)量也明顯升高，顯示SIRT1在酒精性肝損傷中起調(diào)控作用。SIRT1下游分子AMPK是廣泛分布于生物體內(nèi)的高度保守的蛋白激酶，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡等多種生物學(xué)作用，可抑制脂肪酸與甘油三酯的合成，促進(jìn)脂肪酸氧化分解，從而影響脂質(zhì)代謝。在肝臟中，AMPK通過磷酸化作用調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，其下游蛋白激酶SREBP-1c是調(diào)控脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子，在酒精性肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究結(jié)果中，酒精性肝損傷小鼠肝組織p-AMPKα蛋白水平降低，SREBP-1c表達(dá)量增加，經(jīng)PHY干預(yù)后，AMPKα的磷酸化增加，SREBP-1c表達(dá)減少，且AMPK激動(dòng)劑AICAR組SREBP-1c表達(dá)量也明顯降低?？傊?，我們的研究結(jié)果提示PHY可能通過激活SIRT1-AMPK通路，調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成與代謝的關(guān)鍵調(diào)控分子，抑制脂肪酸合成，從而在緩解酒精性肝損傷中發(fā)揮重要作用，但是更深入的機(jī)制需采用SIRT1基因敲除鼠及細(xì)胞的進(jìn)一步研究來揭示。

綜上所述，PHY能夠改善慢性喂養(yǎng)液體酒精飼料加急性酒精灌胃所引起的脂肪變性損傷和炎癥水平，對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SIRT1-AMPK信號(hào)通路的活化相關(guān)，確切機(jī)制有待深入探索。