RTX去除TRPV1+感覺神經(jīng)對C57BL/6J小鼠毛發(fā)顏色及生長的影響

劉庶慈，徐溪悅，湯安群，劉 丹，鄭駿年，施 明

(徐州醫(yī)科大學(xué)腫瘤防治研究所,江蘇 徐州 221000)

毛發(fā)顏色及生長能力受多種因素影響，包括基因、年齡、營養(yǎng)、藥物、精神心理因素等[1-2]。盡管最近的研究顯示，毛囊中的多種結(jié)構(gòu)，如毛囊干細(xì)胞[3-4]、血管[5]和神經(jīng)[6-7]等均可以影響毛發(fā)色素沉著和生長能力，但傷害感覺神經(jīng)在其中的作用鮮有報道?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》中有“一日三篦，發(fā)須稠密”的理論，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其解釋為梳齒刺激頭部穴位、疏通十二經(jīng)脈，從而起到滋養(yǎng)毛發(fā)的作用。但從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度，梳齒刺激頭皮的傷害感覺神經(jīng)與促進(jìn)毛發(fā)生長之間是否有關(guān)聯(lián)仍有待研究。

傷害感覺神經(jīng)中有一類重要的神經(jīng)是香草酸瞬時受體亞型Ⅰ(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)陽性感覺神經(jīng)，這類神經(jīng)由于表達(dá)TRPV1通道蛋白，可以被熱、炎癥和化學(xué)刺激激活，介導(dǎo)疼痛或瘙癢的產(chǎn)生[8-9]。樹膠脂毒素(resiniferatoxin，RTX)是TRPV1的高親和力配體，大劑量的RTX可以通過開放TRPV1離子通道，使Ca2+大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞損傷，從而破壞表達(dá)TRPV1的感覺神經(jīng)元。本研究利用RTX去除小鼠TRPV1+感覺神經(jīng)，研究其對小鼠毛發(fā)變白及再生能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物本研究應(yīng)用SPF級4周齡♀C57BL/6J小鼠和Balb/c小鼠各10只，體質(zhì)量(13±1)g，均購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006]，所有小鼠飼養(yǎng)于徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SYXK(蘇)2016-0028]，12 h晝夜交替，溫度控制在(24±1)℃，自由飲食。實驗動物的處理符合福利倫理要求。本實驗遵照動物實驗使用的3R(減少、替代、優(yōu)化)原則給予人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器RTX(批號AI27)購于愛必信(上海)生物科技有限公司；Tween 80(批號WXBC2717V)購于Sigma-Aldrich公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(批號VC2001P)和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(批號1209M036)均購于微科曼得生物工程有限公司。BME-480型熱板測痛儀購于上海玉研科學(xué)儀器有限公司；HH-S1型恒溫水浴鍋購于鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1消融小鼠體內(nèi)TRPV1+感覺神經(jīng) RTX可用于化學(xué)法消融小鼠TRPV1+神經(jīng)[8,10]。4周齡小鼠連續(xù)3 d注射遞增劑量的RTX(30、70、100 μg·kg-1)，RTX溶解于含有體積分?jǐn)?shù)為2%的DMSO和體積分?jǐn)?shù)為0.15%的Tween 80的PBS中，注射方式為小鼠前肢腋下皮下注射。對照組小鼠皮下注射等體積溶劑。RTX注射4周后，進(jìn)行甩尾實驗和熱板實驗(Fig 1A)。甩尾實驗和熱板實驗反映小鼠對熱刺激的敏感度，可評估TRPV1+感覺神經(jīng)去除效果。將小鼠處于垂直放松狀態(tài)，鼠尾浸入52 ℃水浴中，記錄小鼠甩尾反應(yīng)出現(xiàn)的潛伏時間，最長不超過60 s(Fig 1B)。熱板實驗是將小鼠置于52 ℃的熱板測痛儀上，記錄小鼠從開始受到熱刺激到對熱刺激做出相應(yīng)反應(yīng)(如抬起或舔舐后爪)的時間，最長不超過120 s。小鼠對熱刺激敏感性顯著降低，說明成功建立去除TRPV1+感覺神經(jīng)的小鼠模型[11]。

2 結(jié)果

2.1 RTX介導(dǎo)化學(xué)性消融小鼠TRPV1+感覺神經(jīng)4周齡的C57和Balb/c小鼠隨機(jī)分為RTX處理組和溶劑處理組，每組各5只。RTX組連續(xù)3 d皮下注射RTX，溶劑處理組皮下注射等體積的溶劑。4周后進(jìn)行甩尾實驗和熱板實驗。在C57小鼠的甩尾實驗中，RTX處理組小鼠的甩尾反應(yīng)潛伏時間平均值為58.8 s，而溶劑處理組小鼠為2.6 s，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在C57小鼠的熱板實驗中，RTX處理組小鼠的熱反應(yīng)潛伏時間平均值為111.8 s，而溶劑處理組小鼠為38.4 s，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Balb/c小鼠的甩尾實驗和熱板實驗獲得類似結(jié)果，RTX處理組小鼠比溶劑處理組的小鼠對熱刺激做出反應(yīng)的潛伏時間明顯延長，兩組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，F(xiàn)ig 1C)。這些結(jié)果說明已經(jīng)成功建立了去除TRPV1+感覺神經(jīng)的小鼠模型。

Fig 1 RTX-mediated chemical ablationA: Schematic representation of RTX administration; B: Diagram of tail-flick assay; C: Tail-flick assay and hot-plate test results of C57 mice and Balb/c mice: C57-T: tail-flick assay of C57 mice; C57-H: hot-plate test of C57 mice; Balb/c-T: tail-flick assay of Balb/c mice; Balb/c-H: hot-plate test of Balb/c mice. **P<0.01 vs vehicle.

2.2 RTX消融C57小鼠TRPV1+神經(jīng)導(dǎo)致特定部位毛發(fā)脫落及白化RTX處理C57小鼠4周后， C57小鼠局部毛發(fā)變白(Fig 2A)，而溶劑對照組小鼠毛發(fā)顏色未見變化。為了探究毛發(fā)變白的發(fā)生過程，同時驗證所觀察到現(xiàn)象的穩(wěn)定性，重復(fù)上述實驗，并連續(xù)觀察小鼠毛發(fā)變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在RTX皮下注射7 d后，RTX處理的C57小鼠頸部開始出現(xiàn)毛發(fā)脫落及局部皮膚破損。在d 11時，RTX組小鼠頸部的皮膚破損愈合，但背部特定區(qū)域出現(xiàn)毛發(fā)脫落。在d 14時，小鼠脫毛部位開始有新毛發(fā)長出。在d 18時，脫毛部位均長出新的毛發(fā)，但新生毛發(fā)呈白色(Fig 2B)。溶劑對照組的C57小鼠毛發(fā)一直未見變化。然而用RTX處理Balb/c小鼠并持續(xù)觀察，并未發(fā)現(xiàn)毛發(fā)脫落現(xiàn)象(Fig 2C)。因Balb/c小鼠毛發(fā)為白色，無法在本實驗中觀察去除TRPV1+感覺神經(jīng)對Balb/c小鼠毛發(fā)顏色的影響。

2.3 RTX消融C57小鼠TRPV1+神經(jīng)促進(jìn)毛發(fā)再生RTX處理組的C57小鼠在局部毛色變白前出現(xiàn)毛發(fā)脫落的現(xiàn)象(Fig 2B)。為觀察化學(xué)法消融TRPV1+感覺神經(jīng)對C57小鼠毛發(fā)再生的影響，在小鼠注射RTX 4周后剃除實驗組和對照組小鼠的毛發(fā)，觀察小鼠毛發(fā)再生情況。剃除毛發(fā)18 d后，RTX處理組小鼠毛發(fā)重新長出，背部特定部位的毛發(fā)為白色。而溶劑對照組小鼠在剃毛后18 d，毛發(fā)尚未完全長出(Fig 3)。這些結(jié)果提示RTX去除C57小鼠TRPV1+感覺神經(jīng)不僅可以使小鼠出現(xiàn)特定部位的毛發(fā)變白，而且可以加快毛發(fā)的再生速度。

Fig 2 Hair shedding and graying at certain parts resulted from ablating TRPV1+ nerves of C57 miceA: Representative images of C57 mice after subcutaneous RTX injection; B: Representative images of C57 mice continuously investigated after RTX treatment; C: Representative images of Balb/c mice continuously investigated after RTX treatment.

Fig 3 Hair regeneration promoted by ablating TRPV1+ nerves of C57 miceC57 mice were treated with RTX or vehicle. After 4 weeks，the back hair of the mice was shaved，then the regeneration of hair was recorded after 18 days. Here are the representative images.

3 討論

神經(jīng)和毛發(fā)之間的關(guān)系在很早以前就被人們認(rèn)識到，自古就有“一夜愁白頭”的說法，但相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚。有研究證明，皮膚神經(jīng)對毛囊和毛發(fā)生長有營養(yǎng)和調(diào)控作用。1995年，Asada-Kubota[12]報道了化學(xué)法消融交感神經(jīng)抑制新生小鼠毛發(fā)的生長。1999年，Botchkarev等[7]揭示了腎上腺素能神經(jīng)可以調(diào)節(jié)毛發(fā)周期，進(jìn)而影響毛發(fā)生長。2018年，F(xiàn)an等[13]的研究顯示外部光線刺激眼睛可以通過激活交感神經(jīng)，釋放去甲腎上腺素，進(jìn)而激活毛囊干細(xì)胞，促進(jìn)毛發(fā)再生。這些研究主要關(guān)注自主神經(jīng)對毛發(fā)生長的影響，而關(guān)于感覺神經(jīng)對毛發(fā)變白的影響尚未見報道。

本研究發(fā)現(xiàn)，RTX消融C57小鼠的TRPV1+感覺神經(jīng)后，小鼠毛發(fā)出現(xiàn)局部脫落，新生毛發(fā)變白的現(xiàn)象。而且多次重復(fù)實驗的結(jié)果顯示，毛發(fā)脫落及毛色變白僅出現(xiàn)在小鼠的脊柱及坐骨神經(jīng)體表投影附近，而該區(qū)域正是傷害感覺神經(jīng)初級傳入纖維及神經(jīng)元胞體所在部位。所以，我們推測C57小鼠皮下注射RTX引起的局部毛發(fā)脫落及毛色變白的現(xiàn)象有可能是因為消融了TRPV1+感覺神經(jīng),使該神經(jīng)富集部位毛囊萎縮，進(jìn)而出現(xiàn)毛發(fā)脫落和新生毛發(fā)變白。有研究報道，TRPV1的激活可以抑制人頭發(fā)生長[14]，這與本研究中發(fā)現(xiàn)的RTX組小鼠剃毛后毛發(fā)再生速度快于對照組小鼠可以相互印證。但這些現(xiàn)象僅在RTX處理的C57小鼠中出現(xiàn)，在RTX處理的Balb/c小鼠模型中未觀察到毛發(fā)脫落的現(xiàn)象，這可能與這兩種小鼠間存在的基因差別有關(guān)，具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。此外，雖然RTX對TRPV1+感覺神經(jīng)有高選擇性，對其他神經(jīng)無明顯作用，但仍不能排除RTX藥物本身對于實驗結(jié)果的影響，因此，還需要從基因水平去除C57小鼠的TRPV1+感覺神經(jīng)，進(jìn)一步驗證上述結(jié)論。

本研究揭示了RTX去除TRPV1+感覺神經(jīng)可以引起C57小鼠特定區(qū)域毛發(fā)脫落，新生毛發(fā)變白，同時毛發(fā)再生速度加快，提示傷害感覺神經(jīng)與毛發(fā)生長及毛發(fā)變白有關(guān)。相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。